运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株

1、精品文档应用微生物技术实验设计班级：姓名：学号：。1欢迎下载精品文档运用紫外诱变获得并筛选植酸酶高产菌株一 . 实验目的1. 学会从土壤中筛选到植酸酶菌株。2. 掌握紫外诱变菌株的方法。3. 学会从变异的菌株中筛选高产菌。二 . 实验原理植酸（又称为肌醇六磷酸）在多种植物组织（特别是米糠与种子）中作为磷的主要储存形式， 其结构是肌醇的 6 个羟基均被磷酸酯化生成的肌醇衍生物。植酸以植酸钙镁钾盐的形式广泛存在于植物种子内，也存在于动物有核红细胞内，可促进氧合血红蛋白中氧的释放，改善血红细胞功能，延长血红细胞的生存期。植酸本身就是对人体有益的营养品， 植酸在人体内水解产物为肌醇和磷脂， 前者具有抗

2、衰老作用，后者是人体细胞重要组成部分。植酸酶，是催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸（盐）的一类酶的总称，属磷酸单酯水解酶。 具有特殊的空间结构。 植酸酶作为一种新型的饲料添加剂， 能分解饲料中的植酸， 形成禽畜可利用的磷酸， 提高饲料中有机磷的利用率， 减少添加无机磷，降低饲料成本，减轻磷污染，同时解除植酸的抗营养作用，提高饲料的营养价值，具有非常可观的经济效益和生态效益。以微生物的自然变异作为基础的筛选菌种的机率并不很高。因为自发突变率小，一个基因的自发突变率仅为10-610-10 左右。为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。物理因素中目前使用得最方便且十分有效是UV，UV诱变

3、一般采用15w 的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm 处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。在生产和科研中可利用此法获得突变株。从土壤中筛选到一株植酸酶高产菌株， 利用紫外线对该菌株进行诱变提高植酸酶产量，并采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-纤维素阴离子交换层析和 sephadex G-100 凝胶过滤层析对植酸酶进行分离纯化。三 . 实验材料1. 材料（ 1）筛选培养基：1%植酸钙，3%葡萄糖，200U/ml 青霉素钠，0.5%NH4NO3，0.05%KCl，0.003%，MnSO4.4H2O，0.05

4、%MgSO4.7H2O，0.003% FeSO47H2O，1.5%琼脂，pH5.5。（2）液体发酵培养基：1.5%葡萄糖， 0.3%蛋白胨，0.2%（NH4）2SO4，0.05%MgSO47H2O，0.05%KCl，0.003%MnSO44H2O，0.003% FeSO4.7H2O，pH5.5。（ 3）查氏合成培养基：硝酸钠 2g ，磷酸氢二钾 1g ，氯化钾 0.5g ，硫酸镁 0.5g ，硫酸亚铁 0.01g ，蔗糖 30g ，琼脂 1520g ，水 1000mL，pH 自然， 121 灭菌20min。（ 4）斜面培养基： 0.05%MgS047H2O，0.003%MnSO47H2O，0.

5、003%FeSO47H20，麸皮汁 100ml，1.52%琼脂， pH5.5。（ 5）土壤：去除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层5cm-10cm 的土壤。2欢迎下载精品文档2. 仪器水浴锅、培养箱、烧杯、培养皿、灭菌锅、漏斗、试管、摇床、分光光度计、pH试纸、电炉、干燥箱、超净工作台、移液管等四 . 实验步骤1. 流程土壤样品稀释液初筛测量各透明圈与菌落直径的大小保藏菌种复筛菌种鉴定测酶活保藏菌种制备单孢子菌悬液紫外诱变平板初筛摇床复筛测酶活保藏菌种分离纯化2. 方法。3欢迎下载精品文档（ 1）菌株的筛选：土壤样品稀释1105 倍，涂布于筛选培养基上， 30 培养72 h，挑取产生透明圈的

6、菌株。对初筛得到的菌株进行摇瓶复筛，在 220 r/min的转速下发酵培养，测其酶活。-崔志芳 , 刘娜 , 季爱云 .植酸酶产生菌的快速筛选及发酵条件优化J.中国酿造 . 2010(07)（ 2）酶活的测定：钒钼酸铵法略加改进后进行测定。 取 1 ml 粗酶液加入 2 ml 植酸钠溶液并摇匀（对照加入 2 ml 钒钼终止液）， 37 保温反应 30 min，立即加入 2 ml 钒钼终止液（对照加入 2 ml 植酸钠溶液）， 415 nm 测 OD 值，参照磷标准曲线计算酶活。酶活定义：按上述方法，在 pH5.5 的条件下，每分钟从 0.0051 mol 的植酸钠溶液中释放 1 umol 无机

7、磷所需的酶量为一个活力单位（ U）。磷标准曲线制备原理：利用植酸酶水解植酸盐释放无机磷，通过加入酸性钼一钒试剂，使水解反应停止，同时与水解释放出来的无机磷产生颜色反应，形成黄色的钒钼磷络合物，在 415nm波长下测定磷的含量试管号123456标准磷溶液 (ml)00.40.81.21.62无机磷浓度 0246810（ mmol/l ）去离子水 (ml)21.61.20.80.40钒钼终止液222222OD值按 表 加 入 试 剂 后 ， 在 415nm 波 长 下 测 OD 值 ， 并 绘 制 标 准 曲 线 。 - 杨平平 , 王燕 , 史宝军 , 陶文沂 . 对发酵生产植酸酶过程中植酸酶活

8、性测定方法的初步探讨 J. 食品与发酵工业 . 2003(09)(3) 菌种鉴定：将复筛酶活力最高的菌接种于查氏合成培养基上， 28 恒温培养箱培养 3 d 后， 观察菌落形态变化。(4) 单孢子菌悬液制备： 将复筛酶活力最高的黑曲霉菌斜面用 10ml 无菌水洗下，倒入盛有玻璃珠的无菌三角瓶中，手持振荡 20min，用带有无菌脱脂棉的漏斗过滤，然后用无菌生理盐水将所得孢子洗涤2-3 次，制成单孢子悬液。(5)诱变处理：取复筛酶活力最高的菌株的孢子悬液10 ml 加入直径为 9 cm 的无菌培养皿中，在 15W紫外灯下，距离 28 cm，进行诱变处理， 时间依次为 0、3、6、9、12、15mi

9、n。经紫外线诱变后得到的突变株，将其中透明圈与菌落直径比值较大的进行复筛， 测定突变株的酶活。-焦秀凤 , 盛晓莉 ,单继阳 , 蒋立建 .纤维素分解菌的筛选及其紫外诱变J.化学与生物工程.2010(01)(6) 斜面低温保藏法：将菌种接种在适宜斜面培养基的上，待菌种生长完全后，置于 4左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。(7) 植酸酶的分离纯化： 取发酵后的培养液在 4 ，4000 r/min 离心 20 min，取上清液，分别加入固体硫酸铵，使硫酸铵饱和度分别为 20%90%，对植酸酶进行沉淀。沉淀重新溶解在乙酸缓冲液中， 对蒸馏

10、水透析脱盐。 透析后的植酸酶。4欢迎下载精品文档溶液用 DEAE纤-维素阴离子交换层析柱进行分离纯化，用 NaCl 溶液进行线性梯度洗脱，于 280 nm 检测蛋白质，分部收集，测定每管酶活力。将上述洗脱液用 Sephadex G-100 凝胶柱进一步分离，用乙酸缓冲液进行洗脱，于280 nm 波长检测洗脱液中蛋白质的含量，记录洗脱曲线，分部收集酶活力较大的部分。(8)酶学性质研究：用纯化的植酸酶分别在pH 2、2.5 、3、3.5 、4、4.5 、5、5.5 、 6、 6.6 、7、7.5 、8 的乙酸缓冲液中进行酶促反应，测定酶的最适pH。将不同 pH 的植酸酶溶液，在37 处理 30 m

11、in ，测定酶活力，研究酶的pH 稳定性。纯化后的植酸酶溶解在乙酸缓冲液中，分别在不同温度 （20、25、30、35、40、45、50、55、 60、65、70）下进行酶促反应，测定植酸酶的最适温度。将植酸酶溶液分别在不同温度下保温 30min，再在 37 测定酶活力。五 . 注意事项1. 紫外线对人体的细胞， 尤其是人的眼睛和皮肤有伤害， 长时间与紫外线接触会造成灼伤。故操作时要戴防护眼镜，操作尽量控制在防护罩内。2. 空气在紫外灯照射下，会产生臭氧，臭氧也有杀菌作用。臭氧过高，会引起人不舒服，同时也会影响菌体的成活率。臭氧在空气中的含量不能超过0.1 1。3. 去除土层表面枯枝、杂草和砂石，收集距表层 5cm-10cm 的土壤。4. 应用菌株采用斜面低温保存法。将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌株生长充分以后，转移至 4 8冰箱中保存。此法仅用于应用菌种的短期保存，并应随时检查其污染杂菌和变异等情况， 发现异常情况， 经应灭活处理后销毁。 保存时间根据菌种种类而不同，细菌： 1 个月；酵母菌： 2 个月；霉菌及芽胞：3个月。.参考文献1. 杨平平 , 王燕 , 史宝军 , 陶文沂 . 对发酵生产植酸酶过程中植酸酶活性测定方法的初步探讨 J. 食品与发酵工