植物DNA和RNA提取方法

1、实验一植物基因组DNA的提取一、实验目的掌握植物总 DNA 的抽提方法和根本 原理。学习根据不同的植物和实验要求设 计和改进植物总 DNA 抽提方法。二、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物 的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多 种酶类 尤其是氧化酶类 对 DNA 的抽提产 生不利的影响，在抽提缓冲液中需参加抗 氧化剂或强复原剂 如巯基乙醇 以降低这 些酶类的活性。在液氮中研磨，材料易于 破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作 用。十二烷基肌酸钠sarkosyl、十六烷基 三 甲 基 溴 化 铵 hexadyltrimethyl ammomum bromide ，简称为 CTAB、 十二 烷基硫

2、酸钠 sodium dodecyl sulfate ，简称 SDS等离子型外表活性剂，能溶解细胞膜 和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使 DNA 得以游离出来。再参加苯酚和氯仿等有机 溶剂，能使蛋白质变性， 并使抽提液分相， 因核酸DNA、RNA冰溶性很强，经离心后 即可从抽提液中除去细胞碎片和大局部 蛋白质。上清液中参加无冰乙醇使 DNA 沉 淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物 总 DNA 溶液。三、实验材料冰稻幼叶四、主要试剂配方2% CTAB 抽提缓冲溶液 : CTAB 4g NaCl 16.364 g 1M Tris-HCl 20ml0.5MEDTA 8ml,先用 70ml ddH2O

3、 溶解，再 定容至 200ml 灭菌 , 冷却后 % 2-巯基乙醇 400ul氯仿 -异戊醇 24：1：先加 96ml 氯仿， 再加 4ml 异戊醇，摇匀即可。五、实验步骤1. DNA 的提取(1) 2%CTABJ由提缓冲液在65 C水 浴中预热。(2) 取少量叶片(约 1g)置于研钵 中，用液氮磨至粉状；(3) 参加700ul的2%CTAB抽提缓 冲液，轻轻搅动；( 4) 将磨碎液分倒入 ml 的灭菌离 心管中，磨碎液的高度约占管的三分之)(5)置于65 C的水浴槽或恒温箱中， 每隔 10 min 轻轻摇动， 40 min 后取出；( 6)冷却 2 min 后，参加氯仿 -异戊 醇( 24：

4、1 )至满管，剧烈振荡 23 min， 使两者混合均匀；( 7)放入离心机中 10 000 rpm 离心10 min，与此同时，将600卩的异 丙 醇 加 入 另 一 新 的 灭 菌 离 心 管 中；8)10 000 rpm 离心 1 min 后，移 液器轻轻地吸取上清夜，转入含 有异丙醇的离心管内，将离心管 慢慢上下摇动30 sec,使异丙醇与 水层充分混合至能见到 DNA 絮状 物； 910000 rpm 离心 1 min 后,立即 倒掉液体,注意勿将白色 DNA 沉 淀倒出,将离心管倒立于铺开的 纸巾上；1060 sec 后,直立离心管,参加720 的75%乙醇及80卩I 5 M勺 醋酸

5、钠,轻轻转动,用手指弹管 尖,使沉淀与管底的 DNA 块状物 浮游于液体中；11放置 30 min ,使 DNA 块状物 的不纯物溶解； 12 10000 rpm 离心 1 min 后,倒 掉液体，再参加800卩175%的乙 醇,将 DNA 再洗 30 min；(13) 10000 rpm 离心 30 sec 后，立即倒掉液体，将离心管倒立于铺 开的纸巾上；数分钟后，直立离 心管，枯燥 DNA (自然风干或用 风筒吹干)；(14) 参加 50 卩 I x TE(含 RNase缓 冲液，使DNA溶解，置于37 恒 温箱约15 h,使RNA消解；(15) 置于-20r保存、备用。2. DNA质量检

6、测琼脂糖电泳检测，原理和方法见实验二。六、考前须知(1)叶片磨得越细越好。(2)移液器的使用。( 3 )由于植物细胞中含有大量的 DNA 酶，因此，除在抽提液中参加 EDTA抑制 酶的活性外，第一步的操作应迅速，以免 组织解冻，导致细胞裂解，释放出DNA酶，使 DNA 降解 思考题：1. 本实验中所用到的各试剂的作用是什 么 CTAB, 氯 仿 , 异 丙 醇 , 75% 乙 醇 , EDTA2提取基因组 DNA 的方法有哪些各有何 优缺点实验二 多聚酶链式反响(polymerase chain reaction, PCR)基因扩增及 琼脂糖凝胶电泳检测一、实验目的通过本实验学习 PCR 反响

7、的根本原 理，掌握PCR的根本操作技术以及琼脂糖 凝胶电泳技术。二、实验原理PCR用于扩增位于两端序列之间的DNA 区段，即通过引物延伸而进行的重复 双向 DNA 合成。根本原理及过程如下：PCR 循环过程中有三种不同的事件发 生：1模板变性；2引物退火；3 热稳定 DNA 聚合酶进行 DNA 合成。1 变性：加热使模板 DNA 在高温下94-95 C变性，双链间的氢键断裂而形 成两条单链，即变性阶段。2. 退火：在体系温度降至 37-65C, 模板 DNA 与引物按碱基配对原那么互补结 合，使引物与模板链 3端结合，形成部 分双链DNA,即退火阶段。3. 延伸：体系反响温度升至中温 72C，

8、 耐热 DNA 聚合酶以单链 DNA 为模板，在 引物的引导下，利用反响混合物中的 4 种 脱氧核苷三磷酸dNTP,按5到3方向 复制出互补DNA,即引物的延伸阶段。上述 3 步为一个循环，即高温变性 、低 温退火 、中温延伸 3 个阶段。从理论上讲， 每经过一个循环， 样本中的 DNA 量应该增 加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环 的模板，经过2530个循环后DNA可扩 增106109倍。典型的PCR反响体系由如下组分组成：DNA 模板、反响缓冲液、 dNTP、 MgCl2、 两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合 酶。琼脂糖凝胶电泳的原理：琼脂糖是一种 天然聚合长链状分子，沸水中溶

9、解，45 C开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大 小决定于琼脂糖的浓度。 DNA 分子在碱性 环境中带负电荷，在外加电场作用下向正 极泳动。 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动 时，有电荷效应与分子筛效应。 不同 DNA， 其分子量大小及构型不同，电泳时的泳动 率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖 凝胶电泳法别离DNA,主要是利用分子筛 效应，迁移速度与分子量的对数值成反比 关系。溴化乙锭EB为扁平状分子，在 紫外照射下发射荧光。 EB 可与 DNA 分子 形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度 较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以 上，且荧光强度与 DNA 的含量成正比。 用 肉眼观察，可检

10、测到 5 ng 以上的 DNA。三、实验材料及相关试剂基因组DNA,基因特异性引物，PCR 扩增相关试剂，等四、实验步骤1 模板 DNA 的抽提：实验一所得的水稻 基因组 DNA。2. PCR操作(在冰上操作):(1) PCR反响混合液的配制：反响体系 25卩L在无菌的mL离心管中按以下操作 程序加样：反响物加样体积/ |iL顺序终浓度ddH2O1x n10 x Buffer2x n1 x25mmol/L3xnmmol/LMgCl210mmol/L4xn200dNTPp mol/L10 pM上游引51 x np mol/L物10 pM下游引61 x np mol/L物DNA Taq聚合7x n

11、1 U酶(2) 将反响混合液混匀,然后每个PCR 管中分装24卩反响混合液，再加1卩模 板DNA,最后加1滴石蜡油，防止水分蒸 发，然后稍离心。(3) 将PCR管放到PCR热循环仪中， 按以下程序开始循环：94 C 4 min | (预变性)194 L 30 sec,60C 30 sec, 72C 2 min72 C 7 min35个循环(4) 考前须知由于PCR灵敏度非常高，所以应当采取 措施以防反响混合物受痕量 DNA 的污染。a. 所有与 PCR 有关的试剂，只作 PCR 实验用，而不挪作它用。b. 操作中所用的PCR管、离心管、吸管 头等都只能一次性使用。c. 每加一种反响物，应换新的

12、枪头。3. PCR产物的检测：琼脂糖浓度%; EB浓度5卩I /100 ml TBE 1制胶以 150 mL 为例a. 称取 1.8 g 琼脂糖，参加 150 mI 的TBE缓冲液pH，摇匀， 用电子天平称三角瓶的总重 量。b. 电炉上加热， 至琼脂糖完全溶解； 然后在天平上加蒸馏水至原重量 ;c. 用凝胶将制胶板两端封好，插 入适当的梳子，将溶解的琼脂糖(约50C)，倒入其中，直 至厚度为46 mm (如有气泡 要把气泡赶出) ，在室温下冷却 凝固 (约 30 45 min)；d. 将制胶板置于电泳槽中，小心垂直 向上拔出梳子，以保证点样孔完好。( 2 )点样a. 将卩I溴酚蓝参加到PCR产

13、物中， 然后稍微离心；b. 每孔点样 yj蓝色样品混合物将 沉入点样孔下部。( 3 )电泳翻开电源开关，调节电压至 35V/cm(约100 V)，可见到溴酚蓝条 带由负极向正极移动，约 1 小时 后即可观察。( 4)染色将电泳好的凝胶放入含EB的水溶液中 , 染色 15-20 分钟5观察将电泳好的胶置于紫外透射检测仪 上，戴上防护观察罩，翻开紫外灯，可见 到橙红色核酸条带，根据条带粗细，可粗 略估计该样品 DNA 的浓度。如同时有 分子量的标准 DNA 进行电泳，那么可通过线 性 DNA 条带的相对位置初步估计样品的 分子量。6考前须知a. 煮胶时，胶液的量不应超过三角 瓶容量的 1/3，否那

14、么易溢出。b. 煮好的胶应冷却至 50 C左右时 再倒，以免制胶板变形，并减少漏胶的机 会。c. 倒胶注意厚度4-6 mm,充分凝 固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好。 也可待胶稍凝固后，放入4C冰箱10多分 钟，以加速胶的凝固。d. 加样前赶走点样孔中的气泡，点 样时吸管头垂直，切勿碰坏凝胶孔壁，以 免使带型不整齐。e. 一般情况下不必每点一个样品都 换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下 一个样品。凝胶中含有EB,切勿直接用手 接触胶，废弃胶应集中处理，勿乱丢。思考题 ：1 PCR 反响液中主要成分是哪些在 PCR 反响过程中各起什么作用2. 为什么在PCR反响过程中，使用三个 不同的温度变

15、化3. 用PCR扩增目的基因，要想得到特异 性产物需注意哪些事项实验三植物总RNA的提取一、实验目的通 过 本 实 验 学 习 从 植 物 组 织 中 提 取 RNA 的方法二、实验原理RNA 是一类极易降解的分子， 要得到完 整的RNA,必须最大限度地抑制提取过程 中内源性及外源性核糖核酸酶对 RNA 的 降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍,可溶 解蛋白质,破坏细胞结构,使核蛋白与核 酸别离,失活 RNA 酶,所以 RNA 从细胞 中释放出来时不被降解。细胞裂解后,除 了 RNA,还有DNA、蛋白质和细胞碎片， 通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、 均一的总 RNA。三、仪器、药品与试剂配方一仪

16、器1 低温离心机2 分光光度计3 琼脂糖胶电泳系统, 用前先用 1% NaOH溶液浸泡过夜,之后再用DEPC水浸 泡冲洗。4 高压灭菌锅5 研钵、剪刀、一次性手套等(二) 药品1. 焦碳酸二乙酯 (DEPC)2. 吗啉代丙烷磺酸 (MOPS)3. 异硫氰酸胍4. 醋酸钠 (NaAc)5. 氯仿6. 苯酚7. 甲醛8. 乙醇9. 乙二胺四乙酸 (EDTA)10. 琼脂糖11. 异丙醇(三 ) 试剂配方1. % DEPC水0.1ml DEPC 参加 100 ml 三蒸水中，振 摇过夜，再湿热灭菌。2. 2 mol/L NaAc、 mol/L EDTA、4 mol/L 异硫氰酸胍、 4 mol/L

17、LiCl 等均用DEPC水 配制。3. 5X MOPS电泳缓冲液pHMOPSmol/LNaAc 40 mmol/LEDTA 5 mmol/L四、实验步骤 一 总 RNA 的提取方案一1. 实验前 10 天左右播种水稻种子，在3-4 叶期，剪取 1.2 g 幼叶。放入研钵， 在液氮中研磨成粉末状， 移入 10 mL 离心管。参加4 mol/L 异硫氰酸胍4mL苯酚3 mL2 mol/L NaAc (pHmL氯仿mL混匀，冰浴放置 30 min 。2. 4C,8000 r/min ，离心 13 min 。3. 弃沉淀，取上清至另一干净无菌离心 管中。4. 参加2倍体积无水乙醇，-70C, ho5.

18、 4C, 8000 r/min，离心 13 min。6. 弃上清，在沉淀中参加 1 mL 4 mol/L LiCI,使其溶解。7. 移入 mL 离心管中，冰浴 2 ho8. 4C， 13000 r/min ，离心 15 mino9. 弃上清，在沉淀中参加 400 uL DEPC 水，再参加400 uL氯仿，混匀。10. 4C， 13000 r/min ，离心 6 mino11. 取上清 ,并参加 1/10 体积 3 moI/L NaAcpH ， 2 倍体积无水乙醇， -20C 放置 30 min。12. 4C， 13000 r/min ，离心 20 mino13. 将沉淀RNA用70%乙醇洗涤

19、2次。14. 将沉淀RNA室温下稍枯燥。15. 加 30 uL DEPC水溶解，-70C保存。二 总 RNA 的提取方案二利用TRIzol提取液抽提RNA,具体 步骤如下：1. 取幼叶约 250 mg 在液氮中研磨至细 粉,转入预冷的 ml 离心管；2. 参加1 ml TRIZOL提取液震荡摇匀；3. 室温放置 5 min 后,参加 ml 的氯仿, 剧烈摇动离心管 5 min；4. 在8 C条件下，12000 rpm 离心15 min；5. 溶液分为两层, 下层为酚氯仿浅 红色液层,将上层液体移入干 净离心管, 参加 ml 异丙 醇在1530C条件下，沉淀10 min；6. 然后在，28C条件

20、下，12000 rpm离 心 10 min， RNA 沉淀管壁和底部；7. 去掉液体局部， 参加 1 ml 75%酒精洗2 次；8. 风干后，参加25 pl DEPC处理过的水溶解RNA,储藏于-80 C冰箱备用(三) 甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分析总RNA1配制 %变性琼脂糖凝胶 (40 mL)称取0.48 g,参加DEPC水 mL,5X电泳缓冲液 4 mL, 加热使溶解,稍冷却加 入甲醛 mL, 混匀,室温凝固 h.2. RNA 电泳检测样品制备RNA2 卜1甲醛|11甲酰胺口110X MOPS2 口1RNA Loading 2 口1Buffer灭菌的DEPC 4 口1水混合液轻轻混匀并离心，

21、放于65 r下 温育 5 min 后,置于冰上。3. 电泳检测将%变性琼脂糖凝胶放入水平电泳槽中，加1 x MOPS电泳缓冲液，覆盖凝胶 约1 mm。将RNA样品加到凝胶点样孔中， 在 5 V/cm 条件下电泳 30 min ，然后在 EB 中染色 15-20 min ，在紫外灯下观察提取的 RNA的质量。五、考前须知1 在研磨过程中，利用液氮时刻使 组织保持冰冻状态。2RNA 酶是一类生物活性非常稳定 的酶类， 除了细胞内源 RNA 酶外，外界环 境中均存在 RNA 酶，所以操作时应戴手 套，并注意时刻换新手套。思考题：1. 实验中所用到的各试剂的作用是什么 焦碳酸二乙酯 (DEPC), 吗

22、啉代丙烷磺 酸 (MOPS), 异硫氰酸胍 , 醋酸钠 (NaAc), 氯仿,苯 酚 , 甲 醛 , 乙 醇 , 乙 二 胺 四 乙 酸 EDTA, 异丙醇动植物组织 mRNA 提取实验方法一、材料水稻叶片或小鼠肝组织。二、设备 研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰 箱，冷冻真空枯燥器，紫外检测仪，电泳 仪，电泳槽。三、试剂1、无 RNA 酶灭菌水：用将高温烘烤 的玻璃瓶180C 2小时装蒸馏水，然 后参加的DEPC体积/体积,处理过夜 后高压灭菌。2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75% 乙醇，用高温灭菌器皿配制 ，然后装入 高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。3、1层析柱加样缓冲液；20mm

23、ol/LTris Cl； L NaC, 1mmol/L EDTA, % SDS4、 洗脱缓冲液：10mmol/L Tris C-l ,1mmol/L EDTA ，% SDS。四、操作步骤(一)动植物总 RNA 提取 -Trizol 法Trizol 法适用于人类、 动物、植物、 微 生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫 克至几克。用 Trizol 法提取的总 RNA 绝无 蛋 白 和 DNA 污 染 。 RNA 可 直 接 用 于 Northern 斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+ 别离，体外翻译， RNase 封阻分析和分子 克隆。1、将组织在液 N 中磨成粉末后，再 以 50-100m

24、g 组织参加 1ml Trizol 液研磨， 注意样品总体积不能超过所用 Trizol 体积 的 10%。2、研磨液室温放置 5 分钟，然后以 每 1mlTrizol 液参加的比例参加氯仿， 盖紧 离心管，用手剧烈摇荡离心管 15 秒。3、取上层水相于一新的离心管，按 每 mlTrizol 液加异丙醇的比例参加异丙 醇，室温放置10分钟，12000g离心10分 钟。4、弃去上清液，按每 ml Trizol 液加 入至少 1ml 的比例参加 75%乙醇，涡旋混 匀，4C下7500g离心5分钟。5、小心弃去上清液，然后室温或真 空枯燥 5-10 分钟， 注意不要枯燥过分， 否 那么会降低 RNA

25、的溶解度。然后将 RNA 溶 于水中，必要时可 55C -60C水溶10分 钟ORNA可进行mRNA别离，或贮存于70% 乙醇并保存于 -70C。注意 1、整个操作要带口罩及一次性 手套，并尽可能在低温下操作。2、加氯仿前的匀浆液可在-70 C保存 一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在 4 C保存一周，-20 C保存一年。(二) mRNA提取由于mRNA末端含有多poly(A)+，当 总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓 冲 液 作 用 下 ， mRNA 被 特 异 的 吸 附 在 oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏 水中， mRNA 可被洗下，经过两次 oligo

26、(dT) 纤维素柱，可得到较纯的 mRNA。1、用 L NaOH悬浮-1.0g oligo(dT)纤维 素。2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析 柱中或装入填有经 DEPC处理并经高压灭 菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积 为，用 3 倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。3、用 1x 柱层析加样缓冲液冲洗柱床， 直到流出液的 pH 值小于。4、将一中提取的 RNA液于65C 温育 5 分钟后迅速冷却至室温，参加等体 积 2x 柱层析缓冲液， 上样，立即用灭菌试 管收集洗出液， 当所有 RNA 溶液进入柱床 后，参加 1 倍柱床体积的 1x 层析柱加样 溶液。5、测定每一管的 OD260,当洗出液 中 OD

27、 为 0 时，参加 2-3 倍柱床体积的灭 菌洗脱缓冲液， 以 1/3 至 1/2 柱床体积分管 收集洗脱液。6、测定OD260,合并含有 RNA的洗 脱组分。7、参加 1/10 体积的 3M NaAc， 倍体 积的冰冷乙醇， 混匀，-20 C 30分钟。8、4C下12000g离心15分钟，小心 弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4C 下 12000g 离心 5 分钟。9、小心弃去上清液，沉淀空气枯燥10 分钟，或真空枯燥 10 分钟。10、用少量水溶解 RNA 液，即可用于 cDNA 合成(或保存在 70%乙醇中并贮存 于-70C)。注意1、mRNA在70%乙醇中-70C 可保存一年以上。

28、2、oligo(dT)纤维素柱用后可用I NaOH 洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并 参加叠氮钠(NaN3)冰箱保存，重复使用。 每次用前需用 NaOH 水层析柱加样缓冲液 依次淋洗柱床。RNA提取流程RNA( total RNA)和信使 RNA(mRNA的抽提RNA的提取RNA和无RNA酶的环境原核生物能产生功能上截然不同的三种 RNA,信使RNA(mRNA)核糖体RNA (rRNA),转运RNA(tRNA)而真核生物那么能产生四种,还有一种为真核生物所持有的 小是由基因转录而来的，它运送编码蛋白所需的信息由于mRNA代表了基因表 达的水平，因此mRNA的别离，定量和检测极为重要.应用R

29、NA对细胞和分子生物学的各个方面进行研究非常普遍.RNA存在于从简单的逆转录病毒到哺乳动物细胞的所有的生命形式之中 .由于当前没有一种方法能 够直接扩增RNA,因此,RNA的别离通常是决定实验结果质量的第一步，也是关键 的一步.提取RNA过程中防止RNA酶的污染所采取的步骤RNA别离的实用方法既有简单直接的方法(如别离rRNA和tRNA)也有困难和涉 及复杂步骤的方法(如别离mRNA).在无细胞体系中克隆基因的体外转录非常有 用，它可以产生足量的同源RNA分子用作探针或模板以识别和测定表达基因的量 或用于RNA的生化研究，处理RNA样品时必需仔细小心，其程度取决于样品的用 途和来源由于RNA酶

30、存在于所有的生物中并且能够抵抗诸如煮沸这样的物理破 坏，固此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质 RNA很重要.对于制备mRNA来 说这些预防措施尤其重要 .工作区域应与进行普通微生物实验的区域别离好 ,特别是那些用于细菌接种 ,培 养基和试剂配制的区域，那些培养基和试剂用于从细菌和动物细胞中进行DNA的制备和操作.通常认为这些区域富含RNA酶.如有可能，使用标有无RNA酶的商品试管，吸头，溶液和水.通常新的无菌处理过 的塑料试管和吸管无RNA酶，3双蒸水ddH20和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC焦碳酸二乙酯进行处理： 每100mL溶液或水中参加DEPC原液，放在摇床上充分混匀并在37 C

31、下作用数小 时.然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活.4用分子级的试剂和DEPC处理过的水配制的溶液通常没有 RNA酶.5别离RNA以前将一些实验室玻璃制品置于烤箱在 300 C烘烤4h以灭活核酶. 如有可能 ,将其他设备也灭菌处理 .从组织中提取RNA那么要注意：动物器官的解剖器械 存放组织块的玻璃器皿 冻存组织块所用的器皿组织器官的冲洗液人汗含有RNA酶，故在所有步骤中均应戴手套并经常更换. 记住我们的周围环境含有大量的微生物和气雾 ,它们来自吸液操作或来自我们自 己的呼吸.这些可能造成RNA酶的污染一些组织像脾脏可能比其它组织含有更多的RNA酶.细菌比哺乳动物细胞中有更多的RNA酶

32、.因此从这些细胞中制备 RNA应采取更严格的预防措施.别离后的RNA通过琼脂糖凝胶电泳再经溴化乙锭染色后便可检查其是否完整.rRNA18s和28s条带模糊可能说明由RNA酶引起的RNA的降解. 一步法别离 RNA应用从组织或细胞中别离细胞的总 RNA 从液体样品中别离 RNATRI REAGENT Tripure是一种用于RNA别离的商品溶液.该法源于chomc- zynski的RNA别离一步法.它更便于使用并且结果更加可靠.对于来源有限的样 品，我们推荐使用这种试剂.这种试剂能从同一样品中同时别离 RNA, DNA蛋白质.用I mL Tripure/50-100mg 组织匀浆组织样品.对于细

33、胞，每10cm2面积贴壁的单 层细胞或每106个细胞细胞沉淀使用1mL.将样品转至管中.-70 C可保存1月 室温下放置样品5min.每1mL Tripure中参加氯仿并摇动15s,置于室温下 215min.4 C下 12000g 离心 15mi n.将水相上部转至一个新EP管.每1mL Tripure参加异丙醇沉淀RNA将样品置于室温下 510min.4 C ,12000g离心10min.凝胶样沉淀物为 RNA.吸出上清并用1mL 75%乙醇在涡旋振荡器上洗涤 RNA沉淀一次,4 C , 7500g离 心 5min.晾干RNA沉淀.然后用无RNA酶的水，甲酰胺或 的SDS容液溶解沉淀.RNA

34、的检测：将样品稀释液于三处波长处读取 OD 值.记录0D值,通过计算确定RNA浓度或纯度.公式如下对于 ssDNA:ssDNA=33X (OD26一 OD310)淋释倍数 对于 dsDNA:dsDNA=50X (OD26OD 310)稀释倍数 对于 ssRNA:ssRNA=40X (OD26一 OD310H稀释倍数 以上浓度单位为 ug/mL.考前须知1) OD310值是背景，假设盐浓度较高，OD310值也高.2) OD260/OD280对DNA而言其值大约为，高于有RNA污染.低于那么有蛋白质污染.3) OD260/OD280.对RNA而言其值大约为.小结所有可能与RNA接触的器材均得用DEPC处理.操作过程中应带口罩 ,手套.DEPC有致癌之可能,尽量防止接触皮肤 提取的RNA应尽早逆转录成 cDNA.逆转录聚合酶链式反响(RTPCR)RTPCR间接用来扩增从RNA分子今得到的一段特异序列.RNA首先被逆转录为 cDNA用位于一段特异序列或者