实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳ppt课件

1、实验三实验三 DNADNA的琼脂糖凝胶电泳的琼脂糖凝胶电泳一一 实验目的实验目的 经过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测经过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNADNA的方法和技术。的方法和技术。 自从琼脂糖自从琼脂糖agaroseagarose和聚丙烯酰胺和聚丙烯酰胺polyacrylamidepolyacrylamide凝胶凝胶被引入核酸研讨以来，按分子量大小分别被引入核酸研讨以来，按分子量大小分别DNADNA的凝胶电泳技术，曾经的凝胶电泳技术，曾经开展成为一种分析鉴定重组开展成为一种分析鉴定重组DNADNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是如今通用的许多

2、分子生物学研讨方法，如：实验手段，也是如今通用的许多分子生物学研讨方法，如： DNA DNA分型、分型、DNADNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术根底，遭到科学界的高度注重。制酶切作图等的技术根底，遭到科学界的高度注重。 二二 实验原理实验原理 DNA DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 核酸为两性分子，在核酸为两性分子，在pH3.5pH3.5时，整个分子带正电；时，整个分子带正电； pH8pH8左右时，整个分子带负电。左右时，整个分子带负电。 在碱性环境下，核酸

3、分子之糖在碱性环境下，核酸分子之糖- -磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化形状的，把这磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化形状的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖- -磷酸骨架在构磷酸骨架在构造上的反复性质，一样数量的双链造上的反复性质，一样数量的双链DNADNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNADNA分子的这种迁移速度，亦即电泳分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分

4、子本身的大小和构型。的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNADNA分子的迁移速度与相对分子质量分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 可以分别相对分子质量一样，但构型不同的可以分别相对分子质量一样，但构型不同的DNADNA分子。共价闭环超螺旋分子。共价闭环超螺旋DNADNA直线直线DNADNA开环的双链环状开环的双链环状DNADNA。 二二 实验原理实验原理 凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度分别分别DNADNA片段的大小范围片段的大小范围bpbp0.3%琼脂糖琼脂糖50 0001 0000.7%琼脂糖琼脂

5、糖20 0001 0001.4%琼脂糖琼脂糖6 0003004.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺1 00010010.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺5002520.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺501 凝胶的分辨才干同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝凝胶的分辨才干同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨才干就越强。反之，胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨才干就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨才干也就随之减弱。浓度降低，孔隙就增大，其分辨才干也就随之减弱。 DNA DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNADN

6、A的构象、所加电压、电场方向、嵌的构象、所加电压、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。入染料的存在、电泳缓冲液的组成。琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范围为片段的范围为0.250kb0.250kb之间之间 EB( EB(溴化乙锭溴化乙锭) ) 能插入能插入DNADNA分子碱基对之间，导分子碱基对之间，导致致EBEB与与DNADNA结合。结合。DNADNA吸收的吸收的260nm260nm的紫外光传送给的紫外光传送给EBEB，或者结合的，或者结合的EBEB本身在本身在300300和和360360吸收的射线，均吸收的射线，均可在可见光区以可在可见光区以590590波长发射出来，

7、呈橙红色。电波长发射出来，呈橙红色。电泳时所需泳时所需DNADNA样品量仅样品量仅0.50.51g.1g. EB EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng10ng或更或更少的少的DNADNA即可检出；可以加到样品中或胶中。即可检出；可以加到样品中或胶中。 EB EB是诱变剂，运用时一定要戴手套。是诱变剂，运用时一定要戴手套。 EB EB废液废液要经过处置才干丢弃。要经过处置才干丢弃。 在紫外线的照射下结合溴化在紫外线的照射下结合溴化乙锭的乙锭的DNADNA分子发出

8、荧光分子发出荧光三三 实验步骤实验步骤 称样称样溶解溶解加热加热制板制板倒胶倒胶取样取样点样点样电泳电泳检测检测三三 实验步骤实验步骤 制胶制胶 1.0 琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 (50ml) 凝胶板的制备凝胶板的制备 小心参与小心参与23lEB，摇匀污染，摇匀污染EB吸头，不宜吸头，不宜再回收运用再回收运用 点样点样 样品样品20l，与，与4l溴酚兰混匀溴酚兰混匀 ( DNA maker 3l 参与参与10l水与水与4l溴酚兰混匀溴酚兰混匀) 电泳电泳稳压稳压 80v，DNA向阳极挪动向阳极挪动, 大约大约50-60min 察看和拍照察看和拍照254nm紫外灯下察看紫外灯下察看 四四 实验结果实验结果 五五 本卷须知本卷须知 EBEB是一种诱变剂，操作时必需戴塑料或乳胶手套是一种诱变剂，操作时必需戴塑料或乳胶手套!六六 习习 题题 琼脂糖凝胶电泳的适用范围？琼脂糖凝胶电泳的适用范围？2.2.影响琼脂糖凝胶电泳的要素有哪些？影响琼脂糖凝胶电泳的要素有哪些？4 4