基因工程复习

1、基因工程复习总结第一章1.基因工程：利用DNA重组技术，将目的基因与载体DNA在体外进行 重组，然后把这种重组DNA分子引入受体细胞，并使之增殖和表达的 技术2基因克隆：在分子生物学上，人们把将外源 DNA入具有复制能力 的载体DNA中，转入宿主细胞使这得以永久保存和复制的过程称为基 因克隆。（基因工程或重组DNA技术则侧重于验证上述过程所获得遗 传物质新组合在宿主细胞内的表达与功能鉴定）3. 重组DNA技术（RecombinantDNATechnique是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和治疗人类疾病的目的。4.

2、 基因操作：对生物体的遗传物质进行人为的操作，使之发生修饰和改变的过程。5. 遗传工程：用人工手段把一种生物的遗传物质转移到另一种生物的 细胞中去，并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达的技 术。遗传工程，也叫基因工程、基因操作或重组DNA技术。说明基因工程的理论基石和技术基础理论基石（三大发现）：DNA是遗传信息的载体；DNA的双螺旋机构模 型及其半保留复制机理；中心法则和遗传密码及其通用性。技术基础（三大发明）：DNA的体外切割和连接；载体和宿主的 发现、改造和利用；DNA测序、电泳分离和分子杂交（Southern、 Northern 和 West Blot ）简述基因工程研究发展

3、历史1953, Watson和Crick阐明DNA的双螺旋结构1961-1966，破译全部遗传密码1971，获得第1个重组 DNA分子（美国斯坦福大学的 Paul Berg 及其 同事用限制性内切酶将大肠杆菌的DNA切开，并艰难的与病毒 DNA连接，从而获得第一个重组 DNA分子）1972,合成了完整的tRNA基因；P.Berg首次构建DNA1组体1973，Boyer和Cohen建立了 DNA重组技术1977, 重组人生长素抑制因子在大肠杆菌中成功表达1978, 美国Genentech公司在大肠杆菌中成功表达人胰岛素1982,笫一个DNA1组技术生产的动物疫苗在欧洲被批准使用；美国批准重组人胰

4、岛素上市1988, PCR技术诞生：肿瘤敏感基因工程小鼠获美国专利授权1990,第一个体细胞培养方案在美获准；人类基因组计划启动1997,世界上第一只克隆羊问世；转录组学概念提出2003,人类基因组计划的所有目标全部实现2003,中国杨焕明等科学在京完成了对水稻 （籼稻）基因组序 列的测定和初步分析简述基因工程研究的主要内容。1）克隆载体的研发2 ）受体系统的研发 3 ）目的基因研究4）工具酶5） 新技术研究（基因枪、放射性同位素探针、PCR等）简述基因工程的主要应用领域1）基因工程药物（重组活性多肽或蛋白、疫苗和DNA疫苗等）2）转基因作物（抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆及生物反应器等）3）转基

5、因动物（乳腺生物反应器）4）工业（纤维素酶、酿造业菌株、抗菌素生产菌株的工程改造，等）5）环保（生物降解塑料原料基因工程和生物防治农药污染基因工程等）用5个词描述基因工程的过程。（找、剪、连、转、选）第二章 天然DNA勺制备DNA变性：是指双螺旋区氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规线 团状态的过程。DNA复性：变性的DNA勺互补链在适当条件下重新缔合成双螺旋的过程称为DNA勺复性。Tm值：将紫外吸收的增加量达最大量的一半时的温度值称为熔解温度（Tm）举例说明浓缩DNA或 RNA的方法。 乙醇沉淀法：在含阳离子的DNA容液中，加入2倍体积的无水乙醇， 使DNA沉淀。（采用的一价阳离子盐有 Na

6、Ac NaCI或NH4Ag终浓度分别是0.25、1.0和2.0 moI/L ;为了可提高小片段（小于 200 bp）的回收率，可用MgCI2（终浓度为10 mmol/L）。）乙醇处理通常在4C、 10 min以上，若片段比较小（小于1kb），或量比较少（少于0pg/ml）, 则在20 C甚至70 C下沉淀，或延长沉淀的时间。此法沉盐，影 响酶切。 异丙醇沉淀法：在样品中加 1倍体积的异丙醇，冰上10 min以 上，4 C下离心（12 000 g以上）10 min,干燥后溶入TE 20C （RNA 于80 C）保存。此法不沉盐。 正丁醇抽提法：向DNA溶液中加入1倍体积的正丁醇，充分混匀， 以1

7、600 r/min离心l min，弃上相液体。如此重复至液体达到所需 要的体积。然后用水饱和的乙醚抽提 DNA溶液两次，去除正丁醇。最 后在空气中蒸发乙醚。 聚乙二醇浓缩法：将DNA溶液装人透析袋，置于高浓度的聚乙二醇 （PEG600溶液中，4 C下使DNA溶液浓缩至所需要的体积简述DNA与基因工程有关的主要特性。1）变性：在一定的条件下，DNA双链因链间氢键破坏而解链的过程。如温度变性，90C足以使所有的DNA变性；其他，如pH离子强度、 脱水剂等。2）复性：变性DNA分子因链间氢键恢复而重新形成双链 DNA的过程。若是温度变性，当缓慢降低温度时，该过程得以进行。以上是PCR反应的依据。3）

8、带电性：一般pH下，带负电荷，可电泳分离。4）水溶解性：DNA属于生物大分子，且带电荷，通常分子外形成水 膜，可溶于水；但当电荷变化（如等电点）或水膜破坏时，就会沉淀， 这是DNA提取和分离的依据。简要说明天然DNA的主要提取过程。1）生物材料的准备使材料处于提取DNA得率最高的时期，选取最容易提取和含量最 高的组织。如细菌培养至对数生长期后期；植物材料用幼嫩植株，且 暗培养12天或黄化苗；动物以 肝脏为好，须将胆囊除尽。2）细胞的裂解裂解不够，DNA得率低；裂解过猛，DNA断裂。细菌可用溶菌酶、 NaOH+ SDS煮沸、冰冻或超声波等方法处理。动植物组织，先粉碎 材料，再裂解细胞。3）DNA

9、的分离和抽提根据待提DNA的性质，将其与其他组分分离，进一步抽提 DNA 一般先按1:1 （V:V）用酚、酚+氯仿、氯仿对裂解液分别进行抽提， 以除去蛋白质，然后按2:1用乙醇（V:V）或1:1用异丙醇（V:V）在酸性条件下(加1/10体积的3M NaAc pH4.8)沉淀DNA提取质粒DNA寸，先调节裂解液的pH值到12.6，使所有DNA沉淀， 再调节pH值到中性，使质粒DNA复性从沉淀中释放出来。用 RNase 水解除去RNA制备大分子DNA应注意的两个原则：防止和抑制内源Dnase对DNA 的降解；尽量减少溶液中 DNA的机械剪切破坏。第三章分子克隆工具酶限制性核酸内切酶：一类能识别双链

10、DNA中特殊核苷酸序列，并使每 条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。同裂酶：识别序列相同而来源不同的酶。同尾酶：来源和识别序列各不相同，但产生出相同粘性末端的酶限制酶的Star活性：在特定条件下，某些酶在非识别序列处切割 DNA 的现象称为Star活性。限制性图谱：DNA分子上限制性核酸内切酶的识别序列分布图称限制 性图谱(restriction map )，或物理图谱平末端；两条链上的断裂位置处在一个对称结构的中心所形式的断 裂。粘性末端：两链的断裂位置交错、对称地绕着一个对称轴排列所形成 的断裂。衔接头：一段已知序列且含有限制性核酸酶切酶识别序列和粘性末端 的DNA片段连接子：一个

11、较短的已知序列的且能都被限制性核酸酶切酶切割形成特定粘性末端的DNA片段，片段未被内切酶切割时是末端是平末端.连接酶：六大酶类之一，催化两个不同分子或同一分子的两个末端连接的酶。基因工程中常用的酶有哪些？各有何的用途？限制性核酸内切酶：识别 DNA的特异性序列，并在特定位点上切割 DNA将两条链上的一个磷酸二酯键断开， 在基因工程操作中，用同一 内切酶切割载体和目的基因，以形成相同的末端，用于目的基因和载 体连接。DNA连接酶：进行缺刻修复，连接两个 DNA分子；一般利用DNA连接 酶将载体和目的基因连接起来DNA聚合酶：催化DNA的合成，通常用于PCR反应，以后的大量的 目的基因。何谓定向克

12、隆？如何进行？即将待克隆的核酸分子按一定的方向连接入载体的分子克隆方法1, 利用不同的限制性核算内切酶切割目的基因的两端，以形成不同的粘性末端2，在克隆载体的插入位置设置对应的两种不同的内切酶 位点，经对应的内切酶切割后形成与目的基因互补的粘性末端3，DNA连接酶处理目的基因和克隆载体（克隆载体插入位置上设置两个不同的限制性内切酶位点，在外源DNA分子两端也放上相应的两个限制性酶切序列，经限制性酶消化后，所产生的DNA黏性末端分别互 补结合，外源DNA就可定向插入载体。）说明限制性核酸内切酶产生 Star活性的原因及其克服措施。Star活性因限制酶种类、DNA和反应条件的不同而不同，一般是由于

13、 一下原因：高浓度酶、高浓度甘油、低离子强度、 Mn2取代Mg2+或 高pH。克服措施：减少酶的用量，以避免过分酶切 减少甘油浓度 保证反应体系中无有机溶剂或乙醇 提高离子强度到100150mmol/L 降低反应PH至PH7.0 保证使用Mg2+作为二价阳离子等第4、5章分子克隆载体1. 载体：能将所承载的外源DNA片段（基因）带入受体细胞，并在其 中得以维持的DNA分子。2. 表达载体：含有强启动子、外源基因可在启动子的控制下转录成 mRNA并最终以蛋白质的形式在宿主细胞中表达的载体。3. 报告载体：一种易于用生化方法检测表达产物的基因作为报告基因，通常由 p-Basic、p-Enhance

14、r、p-Promoter、p-Control 组成的 载体。4. 质粒载体：以质粒DNA分子为基础构建而成的载体，主要用于原核生物和植物的基因转移以及建立基因组文库和cDNA基因文库。5. 质粒：细菌细胞内一种自我复制的环状双链 DNA分子，能稳定地独 立存在于染色体外，并传递到子代，一般不整合到宿主染色体上。6. ccc-DNA:超螺旋共价闭环DNA分子7. 迁移作用：由共存的结合型质粒引发的非结合型质粒转移的现象称 为迁移作用。8. 接合质粒：含tra基因的质粒，分子较大，拷贝数较少，宿主广， 不安全，使用时应特别注意（tra基因，指令产生菌毛（pilus ），促 使宿主与受体接合，导致遗

15、传物质转移）9. 非接合质粒：不含tra 基因的质粒，分子小，拷贝数多，不会自 行接合转移，比较安全。10. 显性质粒（表达型质粒）：除了控制与本身复制和转移相关的基 因外，还携带其他基因，使宿主呈现出新性状的质粒。11. 隐蔽质粒：宿主细胞含有，但无异样性状表露的质粒12. Cosmid （粘粒载体）：由质粒和含有cos位点的入DNA片段组装成 一类新的克隆载体13噬菌粒载体：由质粒和单链噬菌体的部分序列重组而成的载体，称为噬菌粒（Phagemid或Phasmid）。能以质粒的方式进行高拷贝复 制（500）,在辅助噬菌体存在下，又能以M13噬菌体方式进行复制和 包装。14定位整合克隆载体：除

16、了一般质粒克隆载体必须具备的元件外， 还含一或两个与整合平台区域核苷酸同源的序列（长度最好在1kb以上）。通过同源重组，把外源DNA片段定位整合到整合平台。15. 整合平台：指受体细胞基因组上给定的一个供外源 DNA定位整合 区域。可处于基因区，也可处于基因间隔区。16. YAC （酵母人工染色体）：是将酵母染色体 DNA的端粒（TEL）、DNA 复制起点（ARS和着丝粒（CEN以及必要的选择标记（HISA4和TRP1 基因序列克隆到pBR322中，构建成YAC克隆载体。此克隆载体的sup4 基因上，组装了供插入外源 DNA片段的克隆位点EcoRI17. PAC（ P1人工染色体）：利用P1噬

17、菌体基因组元件所构建的大片 段DNA克隆系统。18. BAC（细菌人工染色体）：利用细菌的F质粒及其调控基因为基础 构建的用于在大肠杆菌中克隆大片段 DNA（10A 300 kb）的细菌染色 体克隆载体。19. 诱导型表达载体：指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达载体。20. 反义表达载体：是利用人工合成或重组的与靶基因互补的一段反义DNA或 RNA片段，特异性地与靶基因结合，达到封闭其表达的目的。21. 组织特异性表达载体：是指有一些特殊的调控序列（如启动子） 可以调控基因只在一定的组织中有效的表达的载体。22. 松弛型质粒：在细菌染色体外能大量独立复制的质粒。

18、每个细菌 中可存在数百到数千个拷贝。23. 严谨性质粒：复制受到严格控制，每个细胞中的数量只有12个，在一定的细胞周期内复制；染色体不复制时，也不复制的质粒。24附加体：一类在细菌和某些真核细胞中存在的染色体外的遗传物质，能在细胞中独立存在并进行自我复制， 也能整合到染色体，随同 染色体的复制而进行复制。25. 转化子：受体菌直接吸收了来自供体菌的 DNA片段，通过交换， 把它组合到自己的基因组中，经这一过程而获得外源遗传物质的受体 菌称为转化子。26. 重组子：含有重组DNA分子的转化细胞。27. 基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特 定基因，从而在生物活体内研究此基因

19、的功能。28. 限制修饰系统：是一种存在于细菌（可能还有其他原核生物），可 保护个体免于外来DNA（如噬菌体）侵入的系统，主要由限制内切酶 和甲基化酶组成的二元系统。29. 质粒不亲和性：不同质粒因亲缘关系密切等原因而表现出不能寓 于同一细胞中的特性30. 多克隆位点：DNA载体序列上人工合成的一段序列，含有多个限 制内切酶识别位点。能为外源 DNA提供多种可插入的位置或插入方 案。31. a-互补：是指lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有 完整的近操纵基因区段的B半乳糖苷酶基因的突变体之间实现互 补。按来源可将基因克隆载体分为哪几类？并说明各自的主要特点。质粒（plasmid ）噬

20、菌体（phage）病毒（virus ）柯斯质粒载体（cosmid）人工染色体（如YAC BAC按功能分类：克隆载体、报告载体和表达载体。作为克隆载体必须具备的主要条件是什么？（1）必须含有允许外源DNA片断组入的合适位点。并且这样的克隆 位点应尽可能的多。（2）克隆载体应能携带外源基因进入受体细胞，或能在受体细胞中 自我复制；或能整合到受体细胞 DNA中同步复制。（3）克隆载体必须含有供选择用的标记基因。以有利于克隆子的筛 选和鉴定。（4）克隆载体必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并 且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人的细 胞。作为表达载体必须具备的主要条件是什么

21、？如何鉴定转化子、重组子和转基因生物？第六章PCR技术及其应用PCR即聚合酶链式反应，是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法， 由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行,使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、 省时等特点。RT-PCR即反转录多聚酶链式反应，是对特定的RNA分子进行扩增的 技术，可分成两个部分：（1）将目的RNA反转录（RT）形成cDNA;（2）以此cDNA为模板进行聚合酶链式扩增（PCR。定量PCR在PCF体系中加入荧光基因，利用荧光信号的累积实现实 时监测整个PCR进程，对起始模板定量分析的方法。反向PCR反向PCR（invers

22、e PCR）是用反向的互补引物来扩增两引物 以外的未知序列的片段。RACE cDNA末端快速扩增技术是基于 mRN版转录和PCR技术建立 起来的、以部分的已知区域序列为起点，扩增基因转录本的未知区域， 从而获得mRN完整序列的方法。简单的说就是从转录本中快速增长 cDNA5和cDNA3末端，进而获得获得全长 cDNA的方法。（转录本 是由一条基因通过转录形成的一种或多种可供编码蛋白质的成熟的mRN。TAIL-PCR热不对称交交错PCF是一种用来分离与已知序列邻近的未 知DNA序列的分子生物学技术。该技术以基因组 DNA作为模板，利 用依照目标序列旁的已知序列设计的 3个较高退火温度的嵌套特异

23、性引物(special primer, SP),和一个较短且Tm值较低的随机简并 (arbitrarydegenerate, AD)引物组合， 通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行 PCR扩增，获得已知序列的侧翼序列。巢式PCR巢式PCF是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR 引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第 二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCRT增片段的内部)结 合在第一次PCR物内部，使得第二次PCRT增片段短于第一次扩增。 巢式PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能 在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。

24、因此，巢式PCR的扩增非常特异。特殊PCR主要有那些？各自的原理是什么？RT-PCR:RN在逆转录酶作用下可以逆转录形成 CDNA,CDN可以在DNA 聚合酶的作用下进行复制扩增。实时定量PCR:反向PCR荧光基因在PCR反应过程中能产生荧光信号，特殊设备可 以识别荧光信号，实时定量PCRS过荧光信号的强弱来监控 PCR反应过程RACE言使RNA勺具有5帽子结构和3多聚A尾巴结构，可以根据 这个特点构建引物，其中 5端利用酶切割后加上接头，3端可以 利用多聚T作为引物，从而快速构建增长 CDNA5和CDNA3末端TAIL-PCR:利用依照目标序列旁的已知序列设计的 3个较高退火温 度的嵌套特异

25、性引物，和一个较短且Tm值较低的随机简并引物组合，通过3轮具热不对称的温度循环的分级反应来进行 PCRT增，获 得已知序列的侧翼序列。巢式PCR巢式PCF是一种变异的聚合酶链反应(PCR)，使用两对PCR引物扩增 完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物 称为巢式引物(因为他们在第一次PCRT增片段的内部)结合在第一 次PCR产物内部，使得第二次 PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式 PCR的好处在于，如果第一次扩增产生了错误片断，则第二次能在错 误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。如何设计PCR引物?引物长度：15-30bp，常用为20mer左右，有效长度不能大 于3

26、8mer引物扩增跨度：以500bp为宜,特定条件下可扩增长至10kb 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 避免引物内部出现二级结构 引物3 端的碱基要求严格配对，特别是最末及倒数第二个碱基， 以避免因末端碱基不配对而导致 PCF失败 引物5有或加上合适的酶切位点 引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 引物量：每条引物的浓度 0.1 lumol或10 100 pmol，以最低 引物量产生所需要的结果为好试述PCF反应的原理与应用.原理：类似于DNA勺天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端 互补的寡核苷酸引物。PCF由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构 成：模板DNA勺

27、变性：模板DNA经加 热至93C左右一定时间后， 使模板DNA双链或经PCRT增形成的双链DNA军离，使之成为单链， 以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火（复 性）:模板DNA经加热变性成单链后，温度降至 55C左右，引物与模 板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-弓|物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模 板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。应用：PCR技术的主要应用于基因克隆，即

28、利用 PCR技术扩增目的基 因；基因检测，如遗传病的检测；基因配型，如 HLA系统基因分析； 基因鉴定，如亲子鉴定第7、8章 目的基因制备与筛选策略SSH （抑制性减法杂交）：是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消 减杂交步骤结合为一体的技术，其核心技术是抑制性PCRRDA代表性差别分析技术）：是一种利用PCRM有指数形式扩增双链， 线性形式扩增单链模板的特性，通过降低 cDNA群体的复杂度和多次 更换cDNA两端接头引物等方法，达到克隆基因的目的的技术。DDRT-PCRmRN差别显示或称差别显示反转录 PCR：是由Liang和Pardee（1992）建立的一种分离、鉴定差别表达基因的方法，

29、具有与 PCR技术相似的简单、快捷和高效等特点。ESTs利用表达序列标签（EST）即基因序列中一段含有足够的结构 信息以显示出该基因与其他基因的差异， 能特异地标记或表征基因的 序列，长100 500 bp，来寻找新基因的策略即为表达序列标签法 （ESTs）。酵母双杂交：是根据真核生物转录调控的特点创建的一种体内鉴定基 因的方法，是一种研究蛋白质一蛋白质之间的相互作用的技术，特别是研究蛋白质亚基和另一亚基的相互作用。cDNA文库：由cDNA勺一套随机片段构成，其中每个片断连在一个单 独的载体分子上，储存在宿主（大肠杆菌、噬菌体等）中并能繁殖扩 增，这样包含着细胞全部mRN信息的cDNA克隆集合

30、称为该组织细胞 的cDNA文库。基因组文库：是指将某种生物体的全部基因组 DNA用限制性内切酶或 机械力量切割成一定长度范围的 DNA片段，再与合适的载体在体外重 组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。基因文库：基因克隆的群体。包括互补 DNA文库和基因组文库等。简述cDNA文库构建的原理与步骤原理：高等生物具有大约104-5种基因，但在一定发育阶段的单个细 胞或个体中，仅15%左右的基因表达。可见由mRNA出发反转录而产 生的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。（不明）步骤：先提总RNA再纯化mRNA 合成第一链cDNA 将mRNA-DN转变为双链DNA 将合成的双链c

31、DNA重组到载体上，导入寄主增殖简述基因组文库构建的原理与步骤原理：通过克隆载体使某种生物基因组的全部遗传信息贮存于一个受 体菌的群体，（不确定）步骤：提取研究对象基因组 DNA制备合适大小的DNA片段，或提 取组织或器官的mRN并反转录成cDNADNA片段或cDNA与经特殊 处理的载体连接形成重组DNA重组DNA转化宿主细胞或体外包装 后侵染受体菌；阳性重组菌落或噬菌斑的选择。简述酵母双杂交的原理与步骤基本原理：酿酒酵母的半乳糖苷酶基因的转录激活因子 GAL4的N端 1147位氨基酸区段为一 DNA吉合域（BD）, C端768881位氨基酸 为一转录激活域（AD。DNA-BD识别GAL4效应

32、基因的上游激活序列（UAS，并与之结合。而AD则通过同转录必须的其它成份间的结合 作用，启动UAS下游的基因转录。通过DNA重组把BD与AD分开，并在同一细胞中表达出 BD 和AD多肽，但由于彼此间的空间隔离，不会发生相互作用，故不能 激活效应基因转录。若将BD和AD分别与来自能结合的两个蛋白的基 因融合，BD和AD则在体内重新组装成具有功能的转录因子（图）， 激活UAS下游启动子调节的报告基因的表达。步骤：将已知蛋白质的编码基因插入 pGBT9同时把cDNA片段克隆 在pGAD424t,构成cDNA表达文库。提取上述两种质粒，共转化酵 母寄主菌株HF7c （具报告基因 UAS-promote

33、r-HIS3 ）。在缺少Leu和 Trp的培养基上培养，以便挑选有两种质粒的转化子；同时也在缺少 His、Leu和Trp的培养基上培养，以便挑选能表达相互作用的杂合 蛋白的阳性菌落，从而克隆到与已知蛋白质相互作用的 cDNA。分离目的基因的方法：1）直接分离： 限制酶酶切分离法（适于从简单基因组分离目的基因，如质粒 和病毒） 物理化学法（DNA片段的碱基组成差异较大，其理化性质明显不 同，如浮力密度和解链温度等）有：密度梯度离心法、单链酶解 法及分子杂交法等。 双抗体免疫法（适用于已分离纯化且足以产生特定抗体的蛋白 质） 反转录法2）构建基因组文库分离3）构建cDNA基因文库分离4）利用聚合酶

34、链式反应（PCR扩增目的基因5）基因的化学合成（自学）筛选目的基因的方法：1）根据功能筛选： 特异蛋白分离法（根据特异蛋白的氨基酸序列，按照遗传密码 及其简并性人工合成特异简并探针，从文库中筛选相应的基因） 功能互补法（利用克隆片段与寄主细胞染色体DNA在功能上的互补性直接分离目的基因）。2）根据序列筛选 已知基因序列或同源基因序列克隆法 表达序列标签法 基因表达系列分析法（用来分离不同发育阶段和生理状态下差 别表达基因）3）差别杂交及减法杂交法 差别杂交法（无可供选择的探针，也无任何有关目的基因的序列信息时，可采用此法；该法特别适于分离特定组织或特定发育阶段特异表达基因以及诱导表达基因） 减

35、法杂交技术（通过 DNA复性动力学原理富集目的基因，并以此构建减数文库分离克隆目的基因；尤其适于某些低丰度mRNA的cDNA克隆）4）差别显示法mRNAf别显示也称DDRT-PCR一种分离、鉴定差别表达基因的方法；几乎可检所有表达基因；可同时比较多种细胞类型；可同时展现所有差异；可同时检测基因的上调和下调表达。） 代表性差别分析技术 抑制性减法杂交（SSH5）功能结合法6）DNA插入诱变法（主要用于植物基因克隆分离） 有转座子标签法；T-DNA标签法7）基因定位克隆法（是人类或植物基因的克隆中常用方法，主要根据目的基因在基因组上的位置特性而不是编码产物来克隆基因。）8）分子间相互作用克隆法第9

36、章转基因及其表达转化：重组质粒通过与膜蛋白结合进入受体细胞， 并在受体细胞内稳 定维持和表达的过程称之为转化。转化子：经转化获得外源遗传物质的细胞称为转化子。感受态细胞：感受态细胞指处于能吸收周围环境中 DNA分子的生理状 态的细胞。融合蛋白：通过基因工程方法将编码不同蛋白质的基因片段按照正确的读框进行重组，将其表达后获得的新蛋白质。包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子， 它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水 不溶性的结构称为包涵体(In elusion Bodies ， IB )。转基因沉默(transgene silencing):指外源基因

37、在转基因生物中不能正常表达的现象，启动子(promoter )是一段提供RNA聚合酶识别和结合的DNA序列, 它位于基因的上游。其长度因生物的种类而异，一般不超过 200bp。 启动子是基因表达调控的重要顺式元件，具有如下特征：序列特异性; 方向性；位置特性；种属特异性。增强子(enhancer):能够增强启动子转录活性的 DNA序列。其结 构类似于启动子，由1多个元件组成，每个元件可以与一种或多种 转录调控因子结合。增强子长 501500bp终止子(terminator ): 终止转录的序列。绝缘子(insulator ):是基因表达的调控元件，也是一种边界元件， 能阻止临近的调控元件对其所

38、界定基因的启动子起增强或抑制作用SD序列：存在于原核生物起始密码子 AUG上游712个核苷酸处的 一种4 7个核苷酸的保守片段，它与16S rRNA 3端反向互补，所 以可将mRNA勺AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译 作用。外显子：基因组DNA中出现在成熟RNA分子上的序列。外显子被内含 子隔开，转录后经过加工被连接在一起， 生成成熟的RNA分子。信使 核糖核酸（mRNA所携带的信息参与指定蛋白质产物的氨基酸排列。内含子：真核生物细胞 DNA中的间插序列。这些序列被转录在前体 RNA中，经过剪接被去除，最终不存在于成熟 RNA分子中。内含子和 外显子的交替排列构成了割裂基因。在

39、前体RNA中的内含子常被称作“间插序列”。反义RNAantisense RNA是一类与特定DNA序列互补的小分子RNA 编码反义RNA的 DNA称为反义子RNA interferenee （RNAi）:由双链RNA启动，在多种酶参与下，经 过一系列步骤（包括siRNA的形成和双链降解等）将同源RNA降解的 现象。简述转基因的主要方法与原理1）转化 Ca2+诱导的转化（Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后 者经热击收缩，使胞膜出现空隙，便于外源DNA进入。） 电穿孔法转化（在强大电场的作用下，细菌细胞壁和细胞膜产生缝隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内。） 三亲本杂交接合转化 原生质

40、体转化 基因枪转化2）转导：通过入噬菌体（病毒）颗粒感染途径将外源 DNA分子转移到受体细胞内的过程。简述重组子的筛选与分子鉴定的主要方法和原理筛选：1）载体遗传标记检测 抗药性筛选法 营养缺陷型筛选（载体分子上携带某种营养组份的合成基因，而受体细胞本身不能合成这一营养组份，将转化细胞涂布在不含此营养组 份的培养基上，长出的便是转化子） 显色筛选法（载体分子上携带某种显色酶基因，其表达产物能使细 胞产生颜色反应，从而易于辨认和挑选）2）克隆DNA序列检测（可用于鉴定） 限制性酶切图谱法（对载体上插入的外源DNA片段进行酶切图谱分 析，并以此与目的基因的已知图谱对比， 因此利用这种方法不仅能区

41、分重组子与非重组子，而且还能鉴定目的重组子。 ） 菌落噬菌斑原位杂交法（根据克隆的目的基因或 DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。） DNA序列分析法（在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列）3）外源基因表达产物检测重组子的分子鉴定1）分子大小鉴定2）限制酶酶切3）利用PCF方法筛选确定重组子4） 核酸分子杂交检测法（具有一定同源性的两条核酸（DNA或 RNA 单链在适宜的温度及离子强度等条件下，可按碱基互补配对原则高度 特异地复性形成双链。该技术用于重组子鉴定时，杂交的双方是待测 序列和已知核酸片段（称为探针）。）真核基因表达调控的特

42、点：表现为在特定的时间和特定的细胞内或在特定外界条件下特定基因 表达，从而实现有序的、不可逆转的分化发育过程。因此，特定基因 的表达依赖于一套特定的转录因子与 DNA调控元件之间的相互作用。 大多数真核生物的增强子包含多个不同转录因子的结合位点。当信号传至细胞核时，触发特定激活物与特定增强子准确结合， 形成蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA相互作用的网络，从而激活或促进转录。说明转基因沉默的机制与克服措施。转基因沉默（transgene silencing ）:指外源基因在转基因生物中 不能正常表达的现象，其机制主要有：1）位置效应：指基因表达受其在基因组中的位置影响的现象克服措施：基因打靶（定位

43、整合）。2）转录水平沉默：是在 DNA水平上的基因调控，主要由启动子甲基 化或外源基因的异染色质化引起。克服措施：筛选单拷贝插入重组子、选用限制修饰系统缺陷型受体细 胞。3）转录后水平沉默：是在 RNA水平上的基因调控，更普遍。特点是 外源基因能够转录，但mRNA合成后就被降解或被相应的反义 RNA或 蛋白质封闭，因而不能指导 mRNA勺翻译。克服措施：尽量避免（如 利用编码序列的简并性等）。4）翻译后沉默：主要是受体细胞的蛋白酶降解外源蛋白。 克服措施： 融合表达、分泌表达、包涵体表达、选用蛋白酶缺陷型受体。作为基因工程宿主必须具备的主要条件： 便于重组DNA导人。 能使重组DNA急定存在。

44、 便于重组体的筛选。 遗传稳定，易于扩大培养或发酵生长。 安全，无致病性，不造成环境污染。 利于外源基因表达产物积累，或能促进其高效分泌表达。 遗传密码无明显偏倚性。 具有较好的翻译后加工机制。 应用价值高。第10章细菌基因工程融合表达：目的基因与编码具有特殊活性的多肽或蛋白质的基因融合，构建成一个融合蛋白基因，不改变两个基因阅读框的基因表达方 式。融合蛋白：将外源基因与受体菌基因重组在一起，但不改变两个基因 阅读框而表达的蛋白。分泌表达：外源基因含有指导信号肽的表达的序列，使得表达产物通 过运输或分泌的方式穿过细胞外膜进入培养基的基因表达方式包涵体：包涵体是在一定条件下，外源基因的表达产物在

45、大肠杆菌中 积累并致密的聚集在一起形成无膜的裸露结构。转导：借助病毒、噬菌体或其他方法将外源DNA导入细胞并整合到宿 主基因组上的方法。转化：通过外源DNA片段传递遗传信息的过程。转染：利用物理，化学的方法使受体细胞从环境中吸收DNA勺方法表面展示：将外源基因的表达产物定位在微生物表面的基因工程技术试述促进转基因在大肠杆菌中表达的策略。答：1、优化表达载体的设计2、提高稀有密码子tRNA的表达作用3、提高外源基因mRNA勺稳定性4、提高外源基因表达产物的稳定性5、优化发酵过程简述原核生物基因工程常用的载体和受体细胞。答：原核生物基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌，枯草芽孢杆菌， 链霉菌，蓝藻等常

46、用的载体：大肠杆菌表达载体 PBR-322, PUC-18 PUC-19;Gst融合表达载体PGEX,枯草芽孢杆菌整合载体 PDG1730.简述细菌基因工程的主要应用？答：1、在农业领域中生产基因工程农药，抗虫抗病重组微生物，微 生物肥料等。2、在食品和工业中生产基因工程菌，以产生改良的益生菌，生产酶制剂等。3、重组DNA技术生产医用抗生素4、利用环境微生物基因工程菌处理环境中的废弃物简述外源基因在细菌中的主要表达形式及优缺点。答：包涵体 优点：主要存在于细胞质，少数在细胞周质中；易于 分离纯化：包涵体水难溶性和密度远大于其他蛋白， 通过高速离心即 可分离；对蛋白酶有较好的抗性。缺点：没有正确

47、的空间构象，因而 无生物活性。 融合蛋白 优点：利用tag的特性对融合蛋白进行亲和层析等 分离提纯，因而大大简化了重组蛋白的纯化过程； 保护外源蛋白不受 宿主内蛋白酶的降解 缺点：进行基因工程操作比较复杂，成功融合 的蛋白种类不多 分泌型蛋白 优点：简化了发酵后处理的纯化工艺；减少了外源蛋白在细胞内被蛋白酶降解的概率； 有利于形成正确的构象，获得 较好的生物学活性或免疫原性的蛋白质。缺点：要在外源蛋白的 N端加入添加编码信号肽的DNA序列，基因操作相对复杂，同时不能确 保高效的分泌。 整合型外源蛋白 优点：外源基因整合在染色体特定部位， 随着基因组基因稳定的转录和表达缺点：需整合的载体一般是不

48、能在受体细胞内进行自主复制的质粒或温度敏感型质粒。第11章酵母基因工程YEp （酵母附加体质粒）Yip （酵母整合质粒）:是以细菌质粒为基础并携带有一个段酵母基因能整合到酵母染色体上YRp （酵母复制质粒）YCp （酵母着丝粒质粒）营养缺陷型：对某些必需的营养物质（如氨基酸）或生长因子的合成能 力出现缺陷的变异菌株或细胞。必须在基本培养基 （如由葡萄糖和无 机盐组成的培养基）中补加相应的营养成分才能正常生长。简要描述表面展示原理。酵母表面展示主要采用与酵母匹配有关的 a-凝集素和a-凝集素 作为骨架蛋白，与外源基因编码的蛋白质或多肽相融合，使外源基因 编码的蛋白质或多肽表达在酵母细胞壁表面。具

49、体见书本 284页。酵母基因工程的主要宿主有哪些 ？1）酿酒酵母；2）乳酸克鲁维酵母；3）毕赤酵母；4）多形汉逊酵母；5）粟酒裂殖酵母；6）解脂耶氏酵母酵母基因工程的载体有哪些 ？各有和特点？酿酒酵母附加型表达载体（PYES2 ；毕赤酵母整合型分泌表达载体（pPIC9K）酵母转基因的方法有哪些？酵母DNA转化原生质体法离子溶液法电穿孔法为什么说酵母是一个非常重要的基因工程宿主 ？1）全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便；2）具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统；3）大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉；4）能将外源基因表达产物分泌至培养基中；5）不含有特异性

50、的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的基因工 程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS ）;6）酵母菌是最简单的真核模式生物酵母基因工程的应用：1）利用毕赤酵母生产饲料用植酸酶2）利用淀粉酿酒酵母的基因工程3）酵母表达异源蛋白（详见 P286）第12章植物基因工程植物整体转化：全能性：指个体某个器官或组织已经分化的细胞在适宜的条件下再 生成完整个体的遗传潜力。组成型表达启动子：在该类启动子控制下，结构基因的表达大体恒定 在一定水平上，在不同组织、部位表达水平没有明显差异。组织特异启动子：在这启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官 或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。诱导型启动子：是指在某