《核酸分析技术OK》ppt课件

1、核酸分析技术电泳技术电泳技术 负极正极电泳景象 带电粒子在电场中的定向挪动电泳技术 利用电泳景象进展分别分析的技术n样品的电荷效应n 带电多，迁移快琼脂糖凝胶电泳凝胶的挑选效应 分子量小，阻力小，迁移快n主要用于分别鉴定核酸 琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分别琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分别纯化和鉴定核酸的方法纯化和鉴定核酸的方法 琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物 根据琼溶解温度，把琼脂糖分为普通琼脂糖和低熔点琼根据琼溶解温度，把琼脂糖分为普通琼脂糖和低熔点琼脂糖脂糖 低熔点琼脂糖熔点为低熔点琼脂糖熔点为6265，溶解后在，

2、溶解后在37下维持液下维持液体形状约数小时，主要用于体形状约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外片段的回收，质粒与外源性源性DNA的快速衔接等的快速衔接等+_Power琼脂糖凝胶电泳分别DNA凝胶制备上样电泳染色结果察看琼脂糖凝胶电泳分别DNA 凝胶制备浓 度%标 准(kb)高强度(kb)低熔点(kb)低黏度低溶点(kb)0.31500.50.7250.80.5150.8100.8101.00.25120.480.481.20.1560.370.371.50.0840.240.242.00.130.133.00.0510.514.00.10.56.00.010.1 琼脂糖类型琼脂糖类型凝

3、结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/ 规范琼脂糖规范琼脂糖35389095不同厂家不同厂家消费的不消费的不同商品其同商品其凝结温度凝结温度和熔化温和熔化温度有一定度有一定差别差别40428590 高强度琼脂糖高强度琼脂糖34438595 修饰的低熔点修饰的低熔点/ 凝凝点琼脂糖点琼脂糖253563653565 超低熔点超低熔点8154045 低黏性低熔点琼脂低黏性低熔点琼脂糖糖25307038853075不同类型琼脂糖的性质不同类型琼脂糖的性质电泳缓冲液电泳缓冲液 常用三种缓冲液常用三种缓冲液 Tris-硼酸硼酸(TBE)、Tris-乙酸乙酸(TAE)、Tris-磷酸磷酸(TPE) TBE与与T

4、PE：缓冲容量高，：缓冲容量高，DNA分别效果好，但分别效果好，但TPE在在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀沉淀 TAE：缓冲容量低，但价钱较廉价，因此引荐选用：缓冲容量低，但价钱较廉价，因此引荐选用TAE。缓冲液中的缓冲液中的 EDTA 可螯合二价阳离子，从而抑制可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶酶的活性，防止的活性，防止PCR扩增产物降解扩增产物降解琼脂糖凝胶电泳分别DNA加热后加热前 凝胶制备琼脂糖凝胶电泳分别DNA2. 上样三个作用：1添加样品密度保证DNA沉入加样孔内；2使样品带有颜色便于简化上样过程；3其中的染料在电场中以可以预测的泳

5、动速率向阳极迁移。核酸电泳的上样缓冲溶液核酸电泳的上样缓冲溶液6凝胶载样缓冲液凝胶载样缓冲液类型类型6 缓冲液缓冲液储存温度储存温度I0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%二甲苯氰二甲苯氰FF40% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液II0.25%溴酚蓝溴酚蓝室温室温0.25%二甲苯氰二甲苯氰FF15% Ficoll(Type400)水溶液水溶液III0.25%溴酚蓝溴酚蓝40.25%溴酚蓝溴酚蓝%二甲苯氰二甲苯氰FF30%甘油水溶液甘油水溶液IV0.25440% (m/V)蔗糖水溶液蔗糖水溶液核酸电泳的指示剂核酸电泳的指示剂 指示剂：溴酚兰、二甲苯青指示剂：溴酚兰、二甲苯青 溴酚兰：在碱性液体中呈紫

6、兰色，电泳中，溴酚兰的迁移溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性率与双链线性DNA片段片段 二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性性DNA大致相当大致相当琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb琼脂糖凝胶浓度琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率迁移率2Kb1.6Kb琼脂糖凝胶电泳分别DNA3. 电泳琼脂糖凝胶电泳分别DNA4. DNA染色溴化乙锭核酸电泳的染色剂核酸电泳的染色剂溴化乙锭溴化乙锭一种荧光染料，一种荧光染料，EB分子可嵌入核分子可嵌入核酸

7、双链的碱基对之间，在紫外线酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光激发下，发出红色荧光可在凝胶电泳液中参与终浓度为可在凝胶电泳液中参与终浓度为0.5ug/ml的的EB，有时亦可在电泳，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色染色1015min琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核染色，肉眼可见核酸电泳带，其酸电泳带，其DNA量普通量普通5ng溴化乙锭太多，凝胶染色过深，溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡放入蒸馏水浸泡30min后再察看后再察看ethidium bromide，EBN+H2

8、NNH2C2H5Br-琼脂糖凝胶电泳分别DNA5. 结果察看DNA的迁移速率决议要素 1 DNA 1 DNA分子的大小分子的大小 双链双链DNADNA分子迁移的速率与其碱基分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；对数的常用对数近似成反比； 2 2 琼脂糖浓度琼脂糖浓度 浓度越低，一样核酸分子迁移越浓度越低，一样核酸分子迁移越快；快； 3 DNA 3 DNA的构象的构象 超螺旋环状线状切口环状。超螺旋环状线状切口环状。 4 4 凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭 溴化乙锭溴化乙锭EBEB插入双链插入双链DNADNA呵斥其负电荷减呵斥其负电荷减少、刚性和长度添加。少、

9、刚性和长度添加。 5 5 所用的电压所用的电压 低电压时低电压时DNADNA片段迁移率与所用片段迁移率与所用的电压成正比。的电压成正比。 6 6 琼脂糖种类琼脂糖种类 常见的有两种：规范琼脂糖和低常见的有两种：规范琼脂糖和低熔点琼脂糖；熔点琼脂糖；样品的电荷效应和凝胶的挑选效应是分别的主要根据n凝胶是由丙烯酰胺聚合而成聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGE 在在TEMED (TEMED (四甲基乙二胺四甲基乙二胺) ) 催化过硫催化过硫酸铵复原产生的自在基的存在下，丙烯酸铵复原产生的自在基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合构成聚丙烯酰胺酰胺单体的乙烯基聚合构成聚丙烯酰胺的线状长链。的线状长链。 在双功能交

10、联剂如在双功能交联剂如N N，N-N-亚甲双丙烯亚甲双丙烯酰胺的参与下的共聚合反响中，聚丙烯酰胺的参与下的共聚合反响中，聚丙烯胺的交联构成三维带状网格构造。胺的交联构成三维带状网格构造。 网格孔径的平均直径决议于丙烯酰胺网格孔径的平均直径决议于丙烯酰胺和双功能交联剂的浓度。和双功能交联剂的浓度。一一 聚丙烯酰胺凝胶的本质聚丙烯酰胺凝胶的本质 优点 聚丙烯酰胺凝胶具有机械强度好，有弹性，透明，化学性质稳定，对pH和温度变化小，没有吸附和电渗作用小的特点，是一种很好的电泳支持介质。二二 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1 1 变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链用于单链DN

11、ADNA片段的分别或纯化。片段的分别或纯化。 变性的变性的DNADNA在这些凝胶中的迁移率在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。几乎与其碱基组成及序列完全无关。 用途：放射性用途：放射性DNADNA探针的分别、探针的分别、DNADNA测测序反响等。序反响等。 2 非变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶 用于双链用于双链DNA片段的分别和片段的分别和纯化。纯化。 注：迁移率受其碱基组成和序列注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。的影响。 用途：制备高纯度的用途：制备高纯度的DNA片段。片段。 染色染色考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝染色 考马斯亮兰考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶染料，在

12、酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰大吸收峰(lmax)的位置，由的位置，由465nm变为变为 595nm，溶液的颜色，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经过测定也由棕黑色变为兰色。经过测定595nm处光吸收的添加量可知与处光吸收的添加量可知与其结合蛋白质的量。研讨发现，其结合蛋白质的量。研讨发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸基酸(特别是精氨酸特别是精氨酸)和芳香族氨基和芳香族氨基酸残基相结合。酸残基相结合。银染色银染色 银染色液中的银离子银染色液中的银离子(Ag )可与核酸构可与核酸构成稳定的复合物，然后用复原剂如甲醛成稳定的复合

13、物，然后用复原剂如甲醛 使使Ag 复原成银颗粒，可把核酸电泳带复原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。电泳染色。 也用于琼脂糖凝胶染色。也用于琼脂糖凝胶染色。其灵敏度比其灵敏度比EB高高200倍。但银染色后，倍。但银染色后，DNA不宜回收。不宜回收。 DNA DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分别范围在聚丙烯胺凝胶中的有效分别范围丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度%有效分别范围有效分别范围bp二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚蓝溴酚蓝3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30; PAGE电泳安装PAGE的结果察看考马斯蓝染色凝胶成像仪扫描末端终止法Sanger2，3双脱氧核苷三磷酸ddNTP是DNA合成链延伸的抑制剂。核苷酸序列测定DNA序列分析仪：序列分析仪：四色荧光基团标志的四色荧光基团标志的dNTP二DNA的化学法测序： 由Maxam和Gilbert