体外构建复合软质再生颅骨修复材料填充修复颅骨缺损剖析

1、张同星，高 华（冀州市医院神经外科，河北省冀州市053200)体外构建复合软质再生颅骨修复材料修复颅骨缺损的可行性?修复颅骨缺损大鼠模型CT检测* 苏木精-伊红染色体外环境下制 备复合软质再 生颅骨修复材 料对存在颅骨 缺损有良好的 修复效果张同星，男，1973年生, 河北省冀州市人，汉族， 2005年河北医科大学毕 业，主治医师，主要从事 脑出血手术治疗方向的 研究。中图分类号:R318文献标识码:A文章编号：2095-4344（2016）25-03706-07稿件接受：2016-04-17文题释义：骨形态发生蛋白7：成熟的骨形态发生蛋白7由前体的多肽产物经酶水解后，的多肽链经二硫键结合后形

2、成的同源二聚体糖蛋白组成，相对分子质量约为“手掌”。天然骨形态发生蛋白 7存在同源和异源二聚体形式，二聚体形式的骨形态发生蛋白生物学活性主要形式。内源性骨形态发生蛋白Smads的转移，阻断转化生长因子 的合成与降解，发挥抗纤维化作用。水平相关的细胞存活能力。壳聚糖的生理活性：控制胆固醇：2条含139个氨基酸组成 35 000 ,其空间结构形似7是其 7可以通过抑制性Smads途径来抑制信号传递蛋白B的信号转导，从而抵消转化生长因子B的活性，调节细胞外基质骨形态发生蛋白7也是P53家族的靶基因，能够调节与P53生理壳聚糖具有强大的阴离子吸附力，既能阻止脂肪的吸收，又可以将人体血液内的胆固醇排泄掉

3、。抑制细菌活性：壳聚糖在弱酸溶剂中易于溶解，其溶液中含有氨基（NH2+），这些氨基通过结合负电子来抑制细菌。预防和控制高血压： 壳聚糖通过自身的氯离子和氨根离子之间的吸附作用，排泄氯离子，还能降低血管紧缩素H表达，有助于防止高血压的发生。吸附和排泄重金属：壳聚糖是高效的螯合物介质。壳聚糖的吸附能力的大小取决于其脱乙酰度。吸附能力越强。免疫效果：壳聚糖表现岀有选择性的高度抑制口腔链球菌生长的作用， 其他有益细菌的生长。有助于防止高血压的发生。脱乙酰度越大， 同时并不影响摘要背景：临床进行骨缺损修复的过程中，自体骨和异体骨移植等均存在一定的不足和问题， 的治疗效果。目的：观察体外环境下构建的复合软

4、质再生颅骨修复材料修复颅骨缺损的效果。方法：体外环境下以骨形态发生蛋白 7衍生多肽、壳聚糖、纳米羟基磷灰石及胶原制备复合软质再生 颅骨修复材料。取24只SD大鼠，随机等分为对照组和实验组，均制备颅骨缺损模型。对照组和实验 组分别予以单纯壳聚糖/纳米轻基磷灰石/胶原复合材料和复合软质再生颅骨修复材料修复缺损部位。结果与结论：构建的复合软质再生颅骨修复材料呈疏松多孔结构，体外环境下骨形态发生蛋白7衍生多肽的释放量呈现岀不断上升的趋势。与对照组相比，实验组大鼠颅骨缺损区骨密度较高，且与正常骨组织十分接近，植入材料发生降解明显，新骨形成面积较大。表明复合软质再生颅骨修复材料修复 颅骨缺损效果良好。关键

5、词：生物材料；骨生物材料；骨缺损；颅骨缺损；再生颅骨；骨形态发生蛋白；壳聚糖；羟基磷灰石；胶原 主题词：颅骨；骨形态发生蛋白7 ;组织工程无法获得理想体外构建复合软质再生颅骨修复材料填充修复颅骨缺损引用本文：张同星，高华.体外构建复合软质再生颅骨修复材料填充修复颅骨缺损J.中国组织工程研究，2016，20（25）:3706-3712.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.25.009ORCID: 0000-0002-0954-9361（张同星）文章快速阅读:-研究原著骨形态发生蛋白7石复合软质再生颅骨修复材料壳聚糖Ca5（PO4）3（OH）纳米羟1Zhang T

6、ong-xing,Atte nding physicia n,Departme nt of Neurosurgery, JizhouHospital, Jizhou 053200, Hebei Provi nee, ChinaSoft composite materials for bone rege nerati onin vitro in skull repairZhang Tong-xing, Gao Hua (Department of Neurosurgery, Jizhou Hospital, Jizhou 053200, HebeiProvince, China)Abstract

7、BACKGROUND:In the process of bone defect repair, as their respective shortcomings, both autograftand allograft cannot obtain satisfactory outcomes.OBJECTIVE: To observe the effect of soft composite materials for bone regeneration establishedin vitroin skull defect repair.METHODS: Soft composite mate

8、rials for bone regeneration (bone morphogenetic protein 7-derived polypeptide, chitosan, nano hydroxyapatite and collagen) were establishedin vitro . Twenty-fourSprague-Dwley rats were enrolled to prepare skull defect models, and were randomly equivalently divided into two groups. The rats were repa

9、ired with chitosan/nano hydroxyapatite/collagen composite materials as control group, and those repaired with soft composite materials of bone regeneration as experimental group.RESULTS AND CONCLUSION:The soft composite material of bone regeneration exhibited a loose andporous structure and bone mor

10、phogenetic protein 7-derived polypeptide was released in a gradually rising trend. Compared with the control group, bone mineral density of the defect region in the experimental group was higher, which was similar with that of the normal bone tissue, and additionally numerous newborn bones could be

11、found. These results show that the soft bone regeneration composite material exerts a better repair effect in skull defect.Subject headings:Skull; Bone Morphogenetic Protein 7; Tissue EngineeringCite this article:Zhang TX, Gao H. Soft composite materials for bone regeneration in vitro in skull repai

12、r.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(25):3706-3712.0 弓 I言 In troduct ion由于车祸和疾病等不断增加的影响，颅骨缺损的发 生率呈现出上升趋势。颅骨缺损严重影响到患者的身 体健康和正常生活等，需要进行修复治疗。传统的颅骨 缺损修复需要按照不同患者露骨缺损的大小和形状等， 使用不同的材料进行修复。例如在使用钛合金进行修复 的时候，需要在术前手工敲制钛合金网板，手术中还要 反复修形，以更好的符合不同患者缺损部位的生理弯曲 度。但是，这些材料与人体正常的骨组织是截然不同的， 有可能发生排异反应，导致手术失败，无法获得理想的

13、 修复效果2。为此，临床需要寻找更加有效的修复材料， 以达到更好的填充效果。理想的支架材料的要求为有良好的生物相容性， 细胞毒性小、具有可降解性等。壳聚糖具有特殊的理 化性质和生理功能，化学稳定性良好，遇水易分解， 无毒、无害、具有优良的生物相容性。纳米羟基磷灰 石属于可降解的生物材料，具有良好的孔隙结构和生 物相容性等，是十分理想的支架材料，可应用于骨修 复治疗之中。胶原具有很强的伸张能力，可以改善羟 基磷灰石的强度和韧性，使人工骨更加贴近人体天然骨 成分。骨形态发生蛋白能够诱导细胞分化为骨、软骨等,可以在骨修复之中发挥出重要的作用4。骨形态发生蛋白7衍生多肽属于新型的多肽活性分子，具有与骨

14、形态 发生蛋白7类似的生物活性。呈螺旋状空间结构，可以 很好的与支架材料进行复合，改善该复合材料其骨诱导性。作者拟制备与自体骨组织相似的、具有良好生物相容性和骨诱导性以及骨传导的复合软质再生颅骨修复 材料，并以其颅骨缺损动物模型，为临床颅骨缺损治疗 提供参考。1材料和方法Materials and methods1.1设计随机对照动物实验。1.2时间及地点 实验于2015年6至7月在冀州市医院 实验室完成。1.3材料实验动物：健康清洁级 SD大鼠24只，鼠龄4周, 雌雄各半，由长沙天勤生物技术有限公司提供，许可 证号SCXK（湘）2015 - 0011。实验符合动物伦理学要 求，实验方案经河北

15、省冀州市医院动物实验伦理委员 会批准。植入物：纳米羟基磷灰石由四川大学生物材料工程 研究中心提供，为白色粉末，难溶于水，易溶于酸，无 细胞毒性和热原反应等，具有良好的生物相容性。复合软质再生颅骨修复材料构建及应用的主要试剂与仪器:试剂与仪器来源胶原上海博升生物科技有限公司壳聚糖北京嘉康源科技发展有限公司骨形态发生蛋白7衍生多肽潍坊海之源生物制品有限公司醋酸溶液潍坊威森格化工有限公司六氟异丙醇北京索莱宝科技有限公司水合氯醛临沂市泰尔化工科技有限公司多聚甲醛金骏升科技国际有限公司高效液相色谱仪苏州市莱顿科学仪器有限公司X射线断层摄影机上海天美科学仪器有限公司冷冻干燥机江苏舜星科技有限公司扫描电镜复

16、纳科学仪器（上海）有限公司计算机线断层摄影机日立医疗器械（北京）有限公司切片机湖北泰康医疗设备有限公司恒温箱东莞市贝尔试验设备有限公司1.4 方法1.4.1制备复合软质再生颅骨缺损修复材料利用共沉淀法制备复合软质再生颅骨缺损修复材料，配制0.5 mol/L醋酸，将10 g胶原溶于其中。待溶解充分之后， 向上述胶原溶液中缓慢添加H3PO4溶液（0.5 mol/L）和CaCl 2溶液（0.5 mol/L）以及 NaOH 溶液（0.5 mol/L），保持 溶液pH为7.4。对获得的溶液进行充分搅拌，12 h之后对沉淀产物进行冻干，之后磨粉保存备用。将10 g壳聚糖溶解在六氟异丙醇溶剂中，获得黏稠溶液

17、，并添加10 g纳米羟基磷灰石/胶原。利用超声波进行30 min的分 散并置于模具会中进行冷却、成型，之后蒸发有机溶剂，保存备用。将复合材料制成圆柱体（高度为2 mm，直径为5 mm），浸泡在多肽溶液中，并进行真空吸附，最终 的材料多肽负载量为每个棒材1 mg 5。1.4.2骨形态发生蛋白7衍生多肽的体外释放规律将5个复合软质再生颅骨缺损修复材料（圆柱体）2 mLPBS，并置入恒温箱（37 C ）中，连续观察14 d，每天定 时提取释放液，利用高效液相色谱仪对骨形态发生蛋白7衍生多肽的含量进行检测，记录每天的释放量，并绘 制释放曲线。1.4.3颅骨缺损模型的制备大鼠以水合氯醛麻醉，切开颅骨正中

18、线皮肤和骨膜，利用磨钻对左右顶骨制成直径为5 mm的类圆型颅骨全层骨缺损，获得颅骨缺损模 型。将24只大鼠随机等分为对照组和实验组，分别在骨 缺损区植入壳聚糖/纳米轻基磷灰石/胶原复合材料和复 合软质再生颅骨修复材料，材料良好覆盖缺损区域之后 常规分层缝合切口，予以抗感染治疗，并常规喂养。1.4.4取材及CT检测 修复后6和12周，每组取6只大 鼠，处死取脑。对颅脑标本进行 CT三维重建，由资深影 像学医生进行读片。1.4.5苏木精-伊红染色 修复后6和12周，取大鼠颅脑标本进行多聚甲醛固定，EDTA脱钙，常规石蜡包埋切片，予以苏木精-伊红染色，禾U用Image-Proplus 5 图 像分析

19、软件对新骨形成面积进行计算。1.5主要观察指标利用扫描电子显微镜对复合软质再生颅骨修复材料进行扫描，观察其超微结构。骨 形态发生蛋白7衍生多肽体外释放情况。术后不同时 间颅骨缺损动物实验 CT三维重建和组织学观察结果。 术后不同时间颅骨缺损动物实验新骨形成面积。1.6统计学分析数据利用SPSS 18.0软件进行处理，计量资料予以t检验，P 0.05为差异有显著性意义。2结果 Results2.1复合软质再生颅骨修复材料的超微结构扫描电镜观察可见制备的复合软质再生颅骨修复材料呈疏松多孔结构（图1）。2.2骨形态发生蛋白7衍生多肽体外释放情况体外环境下，骨形态发生蛋白7衍生多肽的释放量不断上升（表

20、1，图2）。2.3实验动物数量分析大鼠颅骨缺损区切口均良好愈合，未岀现组织坏死或者感染。纳入的所有大鼠均进 入最终的结果分析，未岀现中途死亡或者脱落现象。2.4颅骨缺损动物的CT三维重建和组织变化修复后6周，CT三维重建可见对照组缺损区存在轻微片状致密影，与正常骨密度相比相对偏低（图3A）;实验组缺损区可观察到存在片状高密度影，且密度与正常骨组织十分接近（图3B）。苏木精-伊红染色结果显示，对照组材料 内部仅有少量成骨细胞长入现象（图4A），实验组材料内部岀现大量成骨细胞长入，且部分材料开始发生降解（图 4B）。修复后12周，CT三维重建结果可见对照组骨缺损 区域的高密度影岀现一定的增强情况，

21、面积也岀现增 大，大约为骨缺损面积的 50% ;实验组大则可观察到骨 缺损区骨缺损完全愈合的情况（图3B）O苏木精-伊红染色结果显示，对照组部分材料发生了降解，并存在未成 熟编织骨分散分布的情况 （图4C）O实验组大部分材料均 发生降解，并被成熟板层骨替代，仅存少量编织骨（图4D）O成面积显著大于对照组（P 2 000)Figure 1 Ultrastructure of the soft composite material of bone regeneration (x2 000)在城分氟珈释肽多 生衍7 7白蛋生发态形骨表1骨形态发生蛋白7衍生多肽体外释放情况(X is, %)Table

22、 1 Release of bone morphogenetic protein 7-derived polypeptide in vitro时间(d)骨形态发生蛋白7衍生多肽释放量10232.00 1.25341.00 3.11446.00 5.25550.00 5.18652.00 也.23753.00 也.59856.00 3.11957.00 3.591058.00 3.691159.00 9.111261.00 10.251363.00 10.581464.00 12.357 J8 9 10o 11i 1i2 13 14图2 骨形态发生蛋白7衍生多肽体外释放情况Figure 2 Re

23、lease of bone morphogenetic protein 7-derived polypeptide in vitro图3 修复后6周颅骨缺损动物的CT三维重建结果Figure 3 Three-dimensional CT reconstruction of rat skull defect at 6 weeks after surgery图注：图中A为对照组，B为观察组，箭头所示为新生骨组织。表2复合软质再生颅骨修复材料对大鼠颅骨缺损部位新骨形成面积的影响(X ，n=6，%)Table 2 Effect of soft composite materials of bone r

24、egeneration on the new bone formation area of the rat skull defect region组别修复后6周修复后12周对照组17.59 3.2550.23 5.25实验组35.15 也.8592.35 9.85P 0.05 0.05骨修复效果。治疗后6周对照组可观察到材料内部仅有 少量成骨细胞长入现象。实验组经组织学观察，可见材 料内部岀现大量成骨细胞长入的情况，且部分材料开始发生降解。治疗后 12周，对照组可观察到部分材料发 图4复合软质再生颅骨修复材料对大鼠颅骨缺损部位组织形态的影响(苏木精-伊红染色，200)Figure 4 Effe

25、ct of the soft composite material for bone regeneration on morphology of the rat skull defect region (hematoxylin-eosinstaining, x200)图注：图中A为修复后6周对照组；B为修复后6周实验组，C为修复后12周对照组，D为修复后12周实验组。黑色箭头为新生骨 组织，白色箭头为复合材料。生了降解，并存在未成熟编织骨分散分布的情况。实验 可观察到不部分材料均发生降解，并被成熟板层骨替 代，仅存少量编织骨。治疗后6周和12周，实验组新骨形成面积大于对照组，表明实验组所使用的

26、材料具有良好的骨诱导性和可降解性，其优良的结构和特性有助 于新骨的形成，可以达到理想的骨再生效果。综上所述，体外环境下制备复合软质再生颅骨修复 材料对存在颅骨缺损的大鼠进行修复治疗，可以获得良 好的修复效果。但受到动物样本容量等因素的限制，实 验结果和相关结论可能存在一定的不足之处，进一步结 果，还有待在今后予以分析。作者贡献：由张同星负责进行实验设计和实施，以及 文章的修改。利益冲突：文章所有作者共同认可文章无相关利益冲 突。伦理问题：实验方案经河北省冀州市医院动物实验伦 理委员会批准。实验动物在水合氯醛麻醉下进行所有的手 术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。文章查重：文章岀版

27、前已经过CNKI反剽窃文献检测 系统进行3次查重。文章外审：文章经国内小同行外审专家双盲审核，符 合本刊发稿宗旨。作者声明：第一作者对研究和撰写的论文中出现的不 端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据 (包括计算 机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、分享和销毁， 可接受核查。文章版权：文章岀版前杂志已与全体作者授权人签署 了版权相关协议。4参考文献Referen ces1王冠聪具有二级三维网络结构的壳聚糖/羟基磷灰石骨组织工程复合支架材料的构建及其生物性能研究D.济南:山东大学，2012.2郭晓东，王明波，黎维勇,等.BMP2活性肽/PLGA复式微球及仿生支架材料的研制C/第九届中国南

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