标记HRP——简易过碘酸钠法

1、实用标准文案标记 HRP 简易过碘酸钠法1. 原理：经典的过碘酸钠法中需采用二硝基氟苯封闭HRP 上残留的 - 和 氨基基以避免酶分子之间的交联。后来Wilson等改用在低 PH 下使 NaIO 氧化 HRP，从而省去了二硝基氟苯封闭HRP 步骤。 HRP 经 NaIO 氧化后形成的醛化酶可与抗体分子的氨基相连，形成斯夫氏硷，后者可进一步用NaBH (或乙醇胺 )还原生成稳定的酶标记抗体试剂及器材(1) 0.1M NaIO ：称取 24.1mg 高碘酸钠溶于 1ml 蒸馏水中。(2) 1mM pH4.4 醋酸钠缓冲液 :0.2M NaAc (1.361克 50ml) 3.7ml0.2M HAc

2、 (0.601ml 50ml) 6.3ml加蒸馏水至 2,000ml 。(3) 0.2M pH9.5 碳酸盐缓冲液 : Na CO 0.32 克NaHCO 0.586 克加蒸馏水至 50ml精彩文档实用标准文案再用蒸馏水作 20 倍稀释，即成 0.01M pH9.5的碳酸盐缓冲液。(4) NaBH 溶液 (4mg ml):临用时称取 NaBH 4mg 溶于 1ml 蒸馏水中。(5) 0.15M pH7.4 PBSKH2PO40.2gNa2HPO4 12H2O2.9gNaCl8.0gKCl0.2g加蒸馏水至 1000mL 。（ 6） 饱和硫酸铵操作步骤(1) 称取 5mgHRP 溶解于 1ml

3、蒸馏水中。(2) 于上液中加入 0.2ml 新配的 0.1M NaIO 溶液，室温下避光搅拌 20 分钟，加入 0.16M 乙二醇水溶液 0.5ml ，混匀， 静置 30 分钟。(3)将上述溶液装入透析袋中， 对 1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析， 4 过夜。精彩文档实用标准文案(4) 加 20 l0.2M pH9.5 碳酸盐缓冲液，使以上醛化桯 HRP 的 pH 升高到 9.0 9.5 ，然后立即加入2mg IgG( 抗体，或 SPA5mg) 在 1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2 小时。(5) 加 0.1ml 新配的 4mg ml NaBH 液，混匀，再置 4 2 小

4、时。(6)将上述液装入透析袋中，对0.15M pH7.4 PBS透析， 4 过夜。结果判定定量和克分子比值测定：可用分光光度计测定(光程 1cm) 。酶量 (mg ml) OD403nm 0.4IgG 量(mg ml) (OD280nm-OD403nm 0.3) 0.62酶量 (mg ml)IgG 量 (mg ml)酶量克分子比值 440,000160,000IgG 量注意事项（ 1）为提高标记效率，应严格掌握整个反应体系中的抗体含量。（ 2）碘酸钠要新鲜配制。(3) 在氧化 HRP 时，以 pH5.6 醋酸盐缓冲液溶解酶为宜。精彩文档实用标准文案(4) 一般认为氧化HRP 5mg ， NaIO 4 量以 0.06mol/L 0.5ml为宜，不能低于0.015mol/L 0.5ml。(5) 氧化 HRP 时间以 15-30min为宜。(6) 加入 DNFB 的目的是为了封闭酶蛋白中残留的a- 和