低剂量顺铂节律化疗抗血管生成作用的实验研究

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减低剂量顺铂节律化疗抗血管生成作用的实验研究（作者：单位：邮编：）作者：牟坤沈方臻肖文静李明君【摘要】目的探讨低剂量顺铂节律化疗对体内外血管生成的抑制 作用。方法采用MTT法检测低剂量顺铂节律化疗对人脐静脉内皮细胞 HUVEC、人肝癌细胞株HepG2增殖的影响；采用流式细胞术检测细胞 周期观察其对HUVECSHepG2生长的影响；采用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM） 模型,观察其对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管的抑制作用。结果低剂量顺 铂（7.5750.0卩g/L ）持续作用24、48、72h,对HUVECs具有抑制 增殖作用，且在7.5750.0卩g/L范围内呈现剂量和时间

2、依赖性， 低 剂量顺铂组的吸光度值明显低于对照组，差异有显著意义（F=14.57 285.44 , q=3.507.63 , P0.05）,且当顺铂浓度达到 750.0卩g/L时对 内皮细胞HUVEC增殖抑制作用达到饱和。相同条件下，低剂量顺铂对 人肝癌细胞株HepG2则未显示出抑制作用，实验组的吸光度值与对照 组比较差异无显著意义（F=0.711.18 , P0.05）。流式细胞仪检测显 示低剂量顺铂组处理HUVEC细胞48h后与对照组比较，随顺铂浓度增 大，G0/G1期细胞比例明显减少,S期细胞比例明显增多，其差异有显 著性(F=6.4412.30,q=3.268.47,P0.05 );低

3、剂量顺铂组处理 HepG2细胞48h后与对照组比较，各期细胞比例无明显改变，差异无 显著意义(F=0.030.10 , P0.05)。低剂量顺铂持续作用对鸡胚尿囊 膜的血管发生具有显著影响，低剂量顺铂组抑制百分率为(30.0 士 5.0 ) %(50.0 士 5.0 ) % 与生理盐水对照组比较差异有显著性 (F=259.04,q=7.7638.80,P0.05)。结论低剂量顺铂节律化疗体外有 抑制血管内皮细胞生长、体内有抑制血管生成作用。【关键词】顺铂；药物疗法；新生血管化，病理性；绒毛尿囊膜20 世纪70年代初,FOLKMAN1提出通过抑制肿瘤新生血管的生 成来抑制肿瘤的生长，为肿瘤的治疗

4、开辟了新的思路。近几年研究显 示，持续或高频率给予比最大耐受剂量(MTD)小得多的单次剂量更有 效,不仅能降低毒性反应，而且能提高抗肿瘤效果2。此外,这种方案 适合与靶向药物及毒性相对低的抗癌药物合用。最新的定义将此称为 “节律化疗”，即高频率甚至每天1次给予比MTD氐得多的化疗药物， 且不伴较长的间歇期。顺铂为一含铂无机络合物，抗瘤谱广、疗效高, 具有与多种抗癌药协同作用的优点，是常用的化疗药物，但其毒副作 用较大，大剂量、多疗程应用可引起体质量下降及肝脏、肾脏毒性等，并可成为不可逆损伤，其是否有抗血管形成作用目前国内外少见报 道。本研究探讨低剂量顺铂节律化疗对体内外血管生成的抑制作用，为临

5、床上应用低剂量顺铂抗肿瘤血管生成治疗提供实验依据。现将结 果报告如下。1材料与方法1.1材料1.1.1细胞株及细胞培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs由美国 Sciencecell公司生产，使用含体积分数 0.10FBS 1OOkU/L青霉素、 100mg/L链霉素的ECh条件培养基常规培养，第46代细胞用于实验。 HepG2细胞系本实验室常规培养，使用含体积分数0.10FBS、100kU/L 青霉素、100mg/L链霉素的DME培养基常规培养。受精WhiteLeghorn6 日龄鸡胚（青岛群兴种禽有限公司）,白色,37.538.0 C ,湿度为60%80%恒温全自动孵化设备孵育。1.1.2主要

6、试剂ECM培养基由美国Sciencecell公司生产；DMEM培养基和胎牛血清（FBS）由兰州民海生物工程公司生产；注射用 冻干型顺铂，购自齐鲁制药有限公司；四甲基偶氮唑盐 （MTT）、甲基 纤维素系Sigma公司产品；二甲基亚砜（DMSO由武汉博士德生物工程 有限公司提供。1.2实验方法1.2.1细胞增殖抑制试验（MTT法）3收集对数生长期的HUVEC及 HepG2细胞，以0.5 x 104/mL分别接种于96孔培养板，于 37C、含体积分数0.05的CO2饱和湿度培养箱中培养,24h后换入顺 铂浓度分别为7.5、75.0、750.0、7500.0卩g/L含药培养液，对照组 用不含药物的培养

7、液换液，然后移至37C恒温、含体积分数0.05的CO2饱和湿度培养箱中继续培养，24、48、72h后各取出一块培养板， 每孔加入5g/LMTT20 L,继续培养4h后，取出96孔培养板，1000r/min 离心5min后，弃孔内培养液。每孔加入150卩L的DMSO振荡10min, 酶标仪测定570nm波长处的吸光度值（A值）,细胞存活率二药物实验组 A值/细胞对照组A值X 100%122细胞周期分析收集对数生长期 HepG2细胞及HUVECs, 以1 X 109/L细胞浓度10mL接种于100mL培养瓶中，孵育24h。按实 验分组分别加入相应药物，继续培养48h后取出各组细胞一瓶，离心， 预冷

8、PBS（pH7.40）洗2次。将经PBS洗后的细胞悬液快速注入装有预 冷1mL含体积分数0.75乙醇的EP管中，混匀,4 C冰箱过夜。PBS洗 2 次,将等体积的细胞悬液和碘化丙啶（PI）染液混合,4 C放置30min。 混合液过300目尼龙网以除去杂质。将样品放入流式细胞仪测定 ，所 得数据输入Macintish650型计算机,分析细胞周期分布。1.2.3鸡胚绒毛尿囊膜（CAM体内血管生长试验4将鸡受精 卵在37C、60唏目对湿度恒温箱中孵育至血管生长高峰时（第7天）， 在照卵灯下寻找胚头右下方血管稀少区域（约胚头右下方0.51.0cm 处），划定1cmX 1cm开窗位置，在鸡胚气室端钻1m

9、mJ、孔并穿透壳膜。 在蛋壳开窗位置用小砂轮磨切开窗，体积分数0.75乙醇消毒，用橡皮吸头从气室小孔轻轻吸气使绒毛膜下沉，用手术剪轻轻揭去蛋壳及 壳膜，暴露出鸡胚尿囊膜。将甲基纤维素薄片放置于尿囊膜毛细血管 新生区,用微量进样器将不同浓度的顺铂 20卩L滴入纤维素薄片上。 对照组用生理盐水，滴入量同顺铂组，用消毒薄膜封窗后放人孵化箱， 继续孵化。每天追加相同剂量的药物,72h后揭去消毒薄膜，加入适 当甲醇、丙酮等量混合固定液，在室温下固定15mi n。待绒毛尿囊膜 血管中的血液凝固后，将薄片周围3cm直径区域内的尿囊膜剪下，光 学显微镜下观察薄片周围毛细血管生长情况，计算其抑制百分率。1.3统

10、计学处理实验数据采用SPSS13.0与PPMS1.55统计软件进行处理，统计方法采用方差分析。2结果2.1低剂量顺铂节律化疗对HUVEC和HepG2细胞的抑制作 用低剂量顺铂作用HUVEC细胞24、48 72h,结果显示均具有 抑制作用，且在一定的范围内呈现剂量和时间依赖性，低剂量顺铂组 的吸光度值明显低于对照组，差异有显著性(F=14.57285.44 ,q=3.507.63 , P0.05),当顺铂浓度达到750.0卩g/L时对内皮细胞增 殖抑制作用达到饱和。相同条件下，低剂量顺铂对人HepG2细胞则未 显示出抑制作用，低剂量顺铂组的吸光度值与对照组比较差异无统计 学意义(F=0.71 1

11、.18 , P0.05)。见表 1。2.2流式细胞仪检测细胞周期变化低剂量顺铂组处理HUVECs细胞48h后，随顺铂浓度增大,G0/G1期细胞比例与对照组比较明显减少，差异有显著性(F=12.30,q=3.208.47,P0.05 ); S期细胞比例明显增多,差异有显 著性(F=6.44,q=3.186.04,P0.05 ); G2/M期细胞比例变化不明显，差异无统计学意义(F=0.16,P0.05)，且当顺铂浓度达到750.0卩g/L 时作用达到饱和。低剂量顺铂组处理HepG2细胞48h后与对照组比较，各期细胞比例无明显改变，差异无统计学意义(F=0.030.10 ,P0.05)。见表 2。

12、表1不同浓度低剂量顺铂对 HUVEC和 HepG2细胞存活率的影响(略)表2不同浓度低剂量顺铂作用 HUVEC和HepG2细胞48h细胞周期分布(略)2.3低剂量顺铂对CAM血管形成的影响本文实验结果显示，低剂量顺铂节律化疗具有抑制CAM新生 血管形成的作用。低剂量顺铂组与生理盐水对照组各取10个受精鸡胚，按上述方法分别加入不同浓度的顺铂及生理盐水，其抑制百分率分别为：顺铂7.5卩g/L组为(30.0 士 5.0 ) % 顺铂75.0卩g/L组为(40.0 士 4.0 ) % 顺铂 750.0 卩 g/L 组为(50.0 士 5.0 ) % 顺铂 7500.0 a g/L组为(50.0 士 4

13、.0) %生理盐水对照组为0%低剂量顺铂组与 生理盐水对照组比较有显著性差异(F=259.04,q=7.76 38.80,P0.05)，且当顺铂浓度达到750.0 a g/L时作用达到饱和。3讨论抗血管治疗作为抗肿瘤治疗研究的热点，仅有少数几种药物，如endostatin、TNP 470批准进入临床应用。近年来，国外研究 发现，不少传统的细胞毒药物在低剂量（非细胞毒浓度）下表现出了抗 血管生成的活性，这种新的化疗方式重新定义了治疗的作用靶位不是 肿瘤细胞而是新生的血管内皮细胞。 MILLER等将此方法称为“抗 血管生成方案”，并提出“重新确定化疗靶向”的观点。有研究报道，50% 的新生血管内皮

14、细胞来自骨髓衍生的循环内皮祖细胞（CEPs）,CEPs可以通过血管内皮生长因子（VEGF）从骨髓进入外周血循环，在那里它们 迁移到血管生成区并分化成成熟的内皮细胞， 抗血管生成化疗阻止血 管修复的部分原因就在于化疗对 CEPs的作用7。目前许多观点支持 这一疗法，包括频率越高越好及剂量越小越好，在短间隔（如每2周1次）内给与一种或多种化疗药物的“剂量密度”疗法已在皿期随机 临床试验中显示出良好效果8,其给药观念在某些方面与节律化疗 相似；一些学者通过数学模型对这种给药模式进行研究分析发现，机体可通过抑制肿瘤新生血管生长，产生持久的抑瘤效果，比常规的最 大耐受剂量化疗可能会更加延长病人的生存时间

15、 9 ;DKLEMEN等10 的实验显示，活性增殖的内皮细胞较增殖的肿瘤细胞对化疗药物更敏 感。低浓度的化疗药物长期持续使用，避免了常规化疗方案中内皮细 胞在化疗间歇期的恢复，增加其抗血管生成效果，起到长期抑制肿瘤 的作用11。低剂量节律化疗的优点为：内皮细胞遗传性状稳定， 不易产生耐药；所需剂量小，无明显毒副作用；血管靶向治疗不 依赖实体瘤类型而异，抑瘤谱广；药物易于到达靶细胞，具有高效 性；能与特异性抗血管生成药物合用，提高疗效12。因此，研究 传统化疗药物的抗血管生成作用不仅具有重要的理论意义 ，同时也具 有临床实际应用价值。顺铂是一种细胞周期非特异性抗肿瘤药物，它通过与DNA链结合，抑

16、制DNA RNA合成和细胞有丝分裂，从而抑制肿瘤生 长，该药已用于多种实体肿瘤的治疗，是目前较为有效的化疗药物之 一。本实验分别挑选了体内、体外两种典型的实验方法探讨低剂量顺 铂持续应用对血管形成的影响。实验结果表明，低剂量顺铂持续应用 在体外可以抑制人血管内皮细胞的增殖，在体内可以抑制鸡胚尿囊膜 血管的新生，抑制作用在7.5750.0卩g/L的浓度下呈剂量依赖性， 当顺铂浓度达到750.0卩g/L时作用达到饱和。同时，在实验所选定的 浓度下，低剂量顺铂在体外未能抑制肿瘤细胞的增殖。提示低剂量顺 铂持续应用对新生肿瘤血管的抑制机制与其细胞毒作用不同，是在非 细胞毒浓度下表现出的特殊能力，是抗癌

17、机制的一个重要方面。总之，低剂量节律化疗抗血管生成作用是近来提出的新观 点，其前期临床试验具有可行性优势，但目前仍有许多挑战需要克服 以提高临床用药的成功率。随着研究的深入，低剂量节律化疗有望成 为晚期肿瘤姑息治疗的一种新选择， 通过提高病人的生活质量，使之 长期带瘤生存，使那些不易治愈的肿瘤成为可控性疾病。【参考文献】1 FOLKMANJ.A ngioge nesisa ndapoptosisJ.Semi nCan cerBiol,2003,13(2):159167.2 HANAHAND,BERGERSG,BERGSLANDE.Lessismore,regularly:metro n omi

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