三七茎叶中叶苷及黄酮的同步分离工艺研究

1、DOC格式论文，方便您的复制修改删减三七茎叶中叶苷及黄酮的同步分离工艺研究(作者：单位：邮编：)【摘要】目的探索分离三七茎叶中的叶苷和总黄酮的工艺条件及参数。方法以静态饱和吸附量、动态比吸附量、比洗脱量 为考察指标，比较不同大孔树脂富集纯化三七茎叶叶苷和总黄酮的性 能，并对最佳树脂纯化工艺进行筛选。 结果AB-8树脂综合性能最佳， 其吸附分离工艺条件为：上样液浓度为叶苷1.806 0 mg/ml,总黄酮0.7852 mg/ml，上样液以1.0 BV/h 吸附流速上样，纯水冲洗，60% 乙醇洗脱后，再用95%乙醇洗脱。结论经大孔树脂纯化后的三七茎叶有效部位中，总黄酮加叶苷的质量分数达 90%说明

2、该纯化工艺是可 行的。【关键词】 三七茎叶；大孔吸附树脂； 有效部位三七茎叶为五加科植物三七 Panax notoginseng (Burk) F. H. Chen 的地上部分，三七叶苷及黄酮是三七茎叶中的有效部位。三七总黄酮与皂苷合用，生理活性最强，分开使用则证明总黄酮能显著增加心肌 冠脉流量1。现代研究表明，三七叶苷有延年益寿和增强机体活力 的作用2;三七黄酮类成分具有增加冠状动脉血流、降低心肌耗氧量、抗心律失常、抗氧化、抗衰老以及增强机体免疫力等功能，具有 治疗老年性痴呆症的可能，其在心脑血管疾病防治及保健等方面有广 泛的应用前景3。三七茎叶在三七道地产地文山资源丰富，大约每 年可收获1

3、0 000 t ,本实验以三七茎叶为原料，以提取物收率（提 取物质量/原料质量）和叶苷、总黄酮的纯度为考察指标，采用醇提 - 树脂法对三七叶苷及黄酮的提取分离与纯化工艺进行了研究，以期为三七茎叶的开发提供依据。1材料三七茎叶购自云南文山三七国际交易市场；人参皂苷Re对照品购于中国生物制品检定所；AB-8树脂为天津南开大学化工厂产品，HPD-100 为河北沧州宝恩化工有限公司产品，D101-大孔吸附树脂（华北地区特 种化学试剂开发中心）；其他试剂均为分析纯。岛津2550型紫外分光 光度计（日本岛津公司）；DZF-6020真空干燥箱（上海一恒科技有限 公司），R201D-H旋转蒸发仪（上海申顺生物

4、科技有限公司）。2方法与结果2.1工艺流程见图1。2.2三七叶苷的含量测定22.2.1标准溶液的配制精密称取人参皂苷 Re对照品0.020 0 g 用甲醇溶解并定容至10.0 ml，即每毫升含人参皂苷 Re 2.0 mg。2.2.2样品测定精密吸取待测液1.0ml于蒸发皿，置于60C水 浴挥干；同样精确吸取人参皂苷 Re标准溶液0.1 ml于蒸发皿中，置 于60C水浴挥干。在已挥干的蒸发皿中，分别准确加入 0.2 ml质量 分数为5%的香草醛冰醋酸溶液，0.8 ml高氯酸，混匀后移入5 ml具 塞刻度离心管中；于60C水浴加热10 min，取出后用流水冷却，再 准确加入5.0 ml冰醋酸溶液摇

5、匀，以1 cm比色池于560 nm波长处 测定吸收值4，并通过下式计算求出含量。叶苷含量（mg/ml）二对照品量x A样/A对样品体积式中：A样，样品吸收值；A对，对照品吸收值；对照品量，标准管 人参皂苷Re的量（mg）;样品体积（ml）。2.3黄酮含量测定4采用分光光度计法测定总黄酮含量，即 利用黄酮类化合物与铝盐反应，产生红色络合物，以芦丁为对照品于 500 nm波长处测定吸收值。2.3.1标准溶液的配制5精密称取于120C干燥至恒重的芦 丁对照品48.35 mg置于50 ml容量瓶中，加乙醇溶解至刻度，摇匀， 精确吸取此溶液10.0 ml置于50 ml容量瓶中，再加水至刻度，摇匀， 即得

6、标准溶液。2.3.2标准曲线的制作精密吸取芦丁标准溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 ml分别置于25ml容量瓶中，各加水至6 ml，再加入 5%的亚硝酸钠溶液1.0 ml，混匀，放置6 min，加入10%硝酸铝溶液1.0 ml，混匀，放置6 min，加入4%氢氧化钠10.0 ml再加水至25 ml，放置15 min （不加芦丁作空白对照）。按分光光度计法在500 nm波 长处测定吸收值。所取标准溶液的浓度和吸收度数据经回归处理， 得回归方程：A= 0.219 6C 0.011 2，其线性范围为 00.6 mg相关 系数 r=0.999 3。2.4上柱液的制备及预处理取干燥的三

7、七茎叶，用70%乙醇溶液为溶剂，料液比为1 : 50（g : ml），回流提取1.5 h，提取2次，合 并提取液，通过减压蒸馏回收乙醇溶液，得到的固形物用一定量的热 蒸馏水溶解、过滤后作为样品溶液，总黄酮浓度为1.570 4 mg/ml，叶苷浓度为3.6120 mg/ml。2.5不同型号树脂筛选2.5.1大孔吸附树脂预处理先将树脂放在水中浸泡，除去浮在表面的树脂（反复几次），再用95%乙醇浸泡24 h，使树脂充分溶胀，湿 法装柱。用95%乙醇以2 BV/h的流速通过树脂层，流至流出液加蒸 馏水不变白色浑浊为止。再用蒸馏水以同样流速洗尽乙醇。将5%的盐酸溶液以46 BV/h流速通过树脂层，并浸泡

8、24h，然后用蒸馏 水以同样流速洗至中性，再用 2%勺NaOH溶液以46 BV/h流速进行 碱洗，用去蒸馏水洗至中性即处理完毕。2.5.2静态吸附试验由于三七叶苷和黄酮的极性较弱，根据相似相溶原理，弱极性的化合物更易被弱极性的树脂所吸附，故本实验选择D101 （非极性）、AB-8 （弱极性）、HPD-100（非极性）作为备选树 脂。在带塞的锥形瓶中，各加入取处理好的树脂1 ml和150 ml上柱液于25C恒温摇床中，振荡24 h，充分吸附后，过滤，取滤液，分 别按“ 2.2 ”和“2.3 ”项下方法测定样品吸附前后叶苷和总黄酮的浓 度,按下式计算各种树脂的静态饱和吸附量（mg/ml湿树脂）。吸

9、附量（mg/ml）二C0-CrW树脂x V式中C0和Cr分别为吸附前后提取液中的质量浓度（mg/ml），W树脂 为树脂的体积（ml） , V为溶液的体积（ml）。结果见表1。表1树脂静 态吸附结果（略）试验结果表明AB-8、HPD-100对叶苷及总黄酮静态饱和吸附量均较 大，D101树脂对叶苷及总黄酮的吸附能力较小。2.5.3树脂动态吸附实验比吸附量是评价树脂真实吸 附能力的指标，是选择树脂种类的参数；比洗脱量是评价树脂解吸能 力与洗脱剂的洗脱能力的指标，也是选择树脂种类及洗脱剂的参数。 本实验以比吸附量和比洗脱量为指标， 对上述3种树脂进行筛选。将 经预处理的树脂30 ml，湿法装柱，径高比

10、为1 : 10,上柱液以1.0 BV/h 流速上样，随时采用FeCI3乙醇溶液检测流出液，以FeCI3反应变绿 为泄露，停止上样，收集过柱液；纯水冲洗至流出液颜色极淡，然后 用95临醇洗脱，流速为1.0 BV/h，洗至无明显FeCl3颜色反应。分 别收集各支柱子的洗脱液，定容，按“ 2.2 ”及“ 2.3 ”项下方法测定 叶苷及总黄酮含量，计算比吸附量、吸附率、比洗脱量、洗脱率。结 果见表23。表2总黄酮动态吸附及洗脱试验结果（略）比吸附量（mg/ml） =M-M残-M水洗 WM上为上柱液中指标成分的含量，M残为流出液中指标成分含量；M 水洗为水洗脱液中指标成分含量；W为树脂体积（ml）。吸附

11、率（% 二CO-CrCOX 100%C0为上柱液指标成分浓度（mg/ml） ； Cr为过柱液中指标成分浓度 (mg/ml)。比洗脱量二M洗脱W M洗脱为洗脱液中指标成分的含量， W为树脂体 积（ml）。洗脱率（%二比洗脱量比吸附量x 100%表23的结果表明，AB-8、HPD-100型大孔树脂对叶苷及总黄酮的动态吸附量、洗脱率均较大，但综合比较可以发现， AB-8树脂的综 合收率（叶苷比洗脱量加总黄酮比洗脱量）最好，因此将 AB-8型大 孔吸附树脂作为进一步分离纯化三七茎叶中叶苷和总黄酮所用树脂。表3叶苷动态吸附及洗脱试验结果（略）2.6纯化工艺参数筛选2.6.1上样吸附参数的筛选上样浓度筛选

12、：取处理好的AB-8大孔吸附树脂，湿法装柱， 取5份上柱液，分别调整总黄酮浓度为 0.196 3，0.392 6，0.785 2,1.570 4，3.1408mg/ml，叶苷浓度为 0.451 5，0.903 0，1.806 0，3.612 0，7.2240 mg/ml。以1BV/h流速上样，然后用纯水洗脱至颜色极淡，计算比吸附量。结果见表4。表4上柱液浓度对比吸附量的 影响（略）从表4可以看出，AB-8树脂的比吸附量随着上样液质量浓度的增加 而增高，当上样液质量浓度升高到总黄酮浓度0.785 2 mg/ml、叶苷浓度为1.806 0 mg/ml时，AB-8树脂的比吸附量趋于饱和。吸附流速的筛

13、选：精确量取相同体积的上述项中确定的最佳上样液浓度的上样液5份，分别以0.5，1，1.5，2, 2.5 BV/h对相同 型号层析柱、相同体积的 AB-8树脂柱进行吸附，然后用蒸馏水洗至 颜色极淡，用“2.2 ”及“2.3 ”项下的方法测定叶苷及总黄酮的含量， 计算出比吸附量。结果见表5。表5吸附流速对比吸附量的影响（略）从表5可以看出，随着吸附流速的增加，树脂比吸附量呈显著下降 趋势，以0.5 BV/h和1.0 BV/h的流速吸附效果基本相近最佳，考虑 到工作量及工作效率等因素，以 1.0 BV/h的流速吸附效果最佳。流 速过快则树脂泄漏严重，有部分树脂吸附还未达到饱和就已经泄漏， 吸附效果明

14、显下降。但若流速过慢，工作量大且工作效率低。2.6.2洗脱参数筛选叶苷与总黄酮的梯度洗脱：将总黄酮浓度为 0.785 2 mg/ml、叶苷 浓度为1.806 0 mg/ml，上样液以1.0 BV/h流速上样达饱和时，用 蒸馏水洗至颜色极淡，分别用 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70，80, 90，100%勺乙醇溶液以1.0 BV/h的流速进行洗脱得不同洗脱液，用“2.2 ”的方法进行测定叶苷含量；用“ 2.3 ”的方法进行测定总黄酮 含量。结果见图2。从图2可以看出，用60%L醇溶液可以把吸附在 AB-8树脂上的大部分叶苷洗脱下来，再用95%L醇溶液（乙醇的一般 商品规格）可

15、以把吸附于 AB-8树脂上的大部分总黄酮洗脱下来。但 由图2可以看出：叶苷与总黄酮仍有一定的交叉，分析其原因：大孔 树脂吸附原理主要为物理吸附，所以比表面积增加，表面张力随之增 大，吸附量提高，对吸附有利。但树脂的实际应用是由树脂的极性、 孔径、孔容及均一性的综合性能决定的。因此，出现此结果，可能是 大孔吸附树脂的均一性差以及装柱效果不理想等因素所造成的。综合以上分析，采用 60%勺乙醇溶液洗脱，富集以叶苷为主要成分 的三七茎叶有效部位（含叶苷87.0%,总黄酮含量为6.4%）;用60%L 醇溶液洗脱后，再以95%勺乙醇溶液洗脱，富集以总黄酮为主要成分 的三七茎叶有效部位（叶苷含量为 13.3

16、%,总黄酮含量为76.5%）。洗脱流速的筛选：根据上述的筛选结果，以60呀口 95%勺乙醇溶液为 洗脱剂，分别米用不同的洗脱流速进行梯度洗脱。 结果见表6。表6洗 脱流速对比洗脱量的影响（略）从表6的实验结果可以看出，当洗脱流速大于 1.5 BV/h时，无论是 采用60%L醇溶液，还是95%的乙醇溶液进行洗脱，叶苷和黄酮的洗 脱率均大幅度下降，故采用1.5 BV/h的洗脱流速进行洗脱。2.7重复性实验采用上样液的总黄酮浓度0.785 2 mg/ml,叶苷浓度为1.806 0 mg/ml的质量浓度上样，以1.0 BV/h的流速吸附， 用蒸馏水洗至颜色极淡，以60%勺乙醇溶液为洗脱剂，洗脱流速为1

17、.5 BV/h，洗脱直至FeCI3乙醇溶液呈现颜色反应，收集洗脱液，改用 95%L醇溶液继续洗脱，至FeCl3乙醇溶液不呈现颜色反应停止洗脱， 收集洗脱液，减压蒸馏回收溶剂，于60 C真空干燥，测定总黄酮及叶苷的含量，并计算提取物总收率。重复实验6次。结果见表7。表7重复性实验结果（略）表7的实验结果表明，采用该工艺提取分离三七茎叶中的叶苷及总 黄酮重复性较好，工艺稳定。3讨论利用醇提、AB-8大孔吸附树脂纯化工艺提取分离三七茎叶中叶苷及黄酮的方法，采用岛津2550型紫外分光光度计测定叶苷及黄酮的含 量，方便快捷，操作成本低。通过考察上样液浓度、上样液洗脱速率 及乙醇洗脱剂浓度对三七茎叶中叶苷

18、及总黄酮分离纯化的影响，确立了提取分离三七叶苷及总黄酮的最佳工艺条件。其工艺为：上样液的 总黄酮浓度0.785 2 mg/ml、叶苷浓度为1.806 0 mg/ml的质量浓度 上样，以1.0 BV/h的流速吸附，用蒸馏水洗至颜色极淡，以 60%勺 乙醇溶液洗脱直至FeCI3乙醇溶液呈现颜色反应，收集洗脱液，改用 95沱醇溶液继续洗脱，至Fecl3乙醇溶液不呈现颜色反应停止洗脱， 收集洗脱液，减压蒸馏回收溶剂，于60C真空干燥至恒重，得到提取物。通过该工艺分离得到的三七茎叶有效部位，60%L醇溶液洗脱部位以 叶苷为主要成分，其叶苷含量达到87注右，总黄酮含量达到 6.7%左右；95%L醇溶液洗脱部位以总黄酮为主要成分，其总黄酮含量为 76.5%左右，叶苷含量为13%右。可以根据提取需要，选择95%醇 溶液洗脱，也可分别用60呀口 95%醇溶液进行分部洗脱。醇提取物 加水溶解后，通过大孔吸附树脂，先用洗脱除尽游离糖等非皂苷成分 后，改用30% 60%L醇洗脱，皂苷被洗脱下来，而总黄酮成分被吸 附在大孔树脂上5。从三七茎叶中提取分离叶苷和总黄酮，使用树 AB-8脂法可 作为初步分离的手段，但从分离效果可以看出，叶苷和黄酮还存在着 较大的交联，对大孔吸附树脂的型号还需要进一步筛选