叶绿体的分离与荧光观察

1、实验二叶绿体的分离与荧光观察一、实验目的了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿 体荧光现象。二、实验原理1、叶绿体的分离应在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中 进行,?以免渗透压的改变使叶绿体受到损伤。利用差速离心法将匀浆液离心，从而使叶绿体得到分离。分离过程最好在05C的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。2、 有些生物体内的物质受激发光照射后直接发出荧光，称为自发荧光（或直 接荧光），如叶绿素的火红色荧光和木质素的黄色荧光等。有的生物材料本 身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光，这种荧光称为次生荧光（或间接荧光），如

2、叶绿体吸附吖啶橙后可发桔红色荧光。本实验利用荧光 显微镜对叶绿体的荧光进行观察。三、实验步骤1. 选取新鲜的嫩白菜叶片，洗净擦干后去除叶梗和粗脉，撕成小碎块，称3g放于玻璃研钵中，加入 10ml0.35mol/LNaCI溶液，匀浆35min。2. 匀浆液用2层尼龙布过滤于50ml烧杯中。3将滤液平分到2个离心管中，天平配平，1000r/min下离心2min。弃去沉 淀。4将上清液在3000r/min下离心5min。弃去上清，沉淀即为叶绿体。5. 将沉淀用0.35mol/LNaCl溶液悬浮，做两张临时装片：取一滴叶绿体悬液滴于载片上，加盖片观察；取一滴叶绿体悬液滴于载片上，再滴加1-2滴0.01

3、%吖啶橙荧光染料，加盖片观察：在普通光镜下观察；在荧光显微镜下观察：先用明视野（白炽光灯下）和用低倍镜头观察， 找到适当的标本后，再转高倍镜头，并将白炽光灯转换成以汞灯激发光 作光源，用暗视野观察。6. 撕取白菜叶片下表皮一小片置于滴有清水的载片上，盖上盖玻片，在普通 光镜下观察气孔的形状，保卫细胞里面的叶绿体；随后转置荧光显微镜下观 察。四、结果与分析观察方式普通显微镜荧光显微镜（自染色后荧光发荧光）叶绿体悬液观察结果保卫细胞叶绿体 观察结果因时间问题， 未拍照片，但和 其他同学一起观 察了。结果分析与讨论1、普通光镜下， 可看到叶绿体为 绿色橄榄型，在 咼倍镜下可看到 叶绿体内部含有 较深

4、的绿色颗 粒，即基粒。2、普通光镜下， 可看到成对出现 的呈半月形的保 卫细胞组成了气 孑L,保卫细胞里 有许多绿色的小 颗粒，即叶绿 体。1、荧光显微镜 下，选用蓝色激 发滤光片，叶绿 体自发荧光为火 红色，背景为黑 色。叶绿体产生 自发荧光的机理 是叶绿体在汞灯 的照射下吸收光 能进入激发态， 从激发态回到基 态时，能在极短 的时间内直接放 射出比照射光波 长更长的光（如可 见光），即自发荧 光。2、荧光显微镜 下，可看到保卫 细胞里的叶绿体 可发出亮红色的 荧光，背景为红 色，气孔仍为绿 色，叶绿体沿着 气孔边沿连成了荧光显微镜下， 选用蓝色激发滤 光片，加入吖啶 橙染色后直接荧 光消失，次生荧 光为桔红色，背 景为黑色。机理：吖啶橙是 一种芳香杂环阳 离子染料可透过 细胞膜，不同浓度的 吖啶橙溶液所呈 现的荧光颜色不 同，低浓度时主 要以单体存在， 较咼的浓度则以 二聚体或多聚体 的形式存在。叶 绿体的自发荧光 消失的原因是荧 光淬火现象所 致。吖啶橙阳离 子是进入叶绿体 膜内通过影响叶环状，其产生自 发荧光的机理如 上分析。（以其 他组同学所拍的 照片为参考）绿素分子结构或 所处的化学环境 使自发荧光淬灭 的。而次发荧光 由来，大部分来 自叶绿体的对吖