高通量技术在牙髓根尖周病相关的口腔微生物宏基因组研究

1、高通量技术在牙髓根尖周病相关的口腔微生物宏基因组研究牙髓病和根尖周病是发生于牙髓、根尖周组织的感染性疾病，多继发于龋病，根管治疗是目前治疗根尖周病最有效的方法。在根管治疗过程中，口腔环境定植微生物种类的多样性、牙髓组织环境的特殊性、根管系统解剖的复杂性以及治理方法的局限性，使得预防口腔微生物对根管系统的污染以及感染根管内微生物的彻底清除困难重重。据文献报道，即使经过完善根管治疗，仍有4%15%的患牙迁延不愈，根管充填后长期残留在根管内的微生物是根管治疗失败的主要原因。彻底清除根管系统内的感染物质，预防根管系统再感染是根管治疗的核心。因此，根管系统疾病的微生物病因学研究一直是人们关注的焦点，全面

2、了解根管內生态环境中微生物的结构组成、相互作用关系和致病机制，将有助于根管治疗中感染控制，从而提髙根管治疗的成功率。传统的针对牙髓根尖周病根管内致病微生物的研究方法包含细菌分离培养鉴定法和电子显微镜组织学检测法，前者以细菌的培养性状、形态特征和生理生化特征为依据来进行区分和分类，而后者只能检测出微生物形态，染色性质，聚集方式。然而，口腔微生物群落是指定植于人体口腔的微生物集合，这些微生物多以生物膜形式组成复杂群落，其中至少有超过50%以上的微生物无法培养。这些传统方法对于难于培养或生长速度较为缓慢的细菌则表现为假阴性结果，更无法对绝大多数微生物的系统发育关系及群落功能进行深度发掘。随着分子生物

3、学技术的飞速发展，不依赖于培养的分子检测手段陆续涌现，包括16SrRNA克隆测序、变性梯度凝胶电泳（denaturedgradientgelelectrophoresis，DGGE）、聚合酶链式反应-末端限制性酶切片段长度多态性分（polymerasechainreaction-terminalrestrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-T-RFLP）、DNA杂交芯片等技术手段。这些技术通常只能检测到环境中的优势菌群，不但费时费力费用高，其检测精度、分辨率不尽如人意，极大限制了对根管系统微生态环境的了解深度和广度。至此，深入分析口腔群落的技术手段亟待改革

4、更新。宏基因组是指生物环境中全部微小生物遗传物质的总和。2005年始诞生的新一代高通量测序技术标志着快速基因组测序时代的到来，其广泛应用为认识口腔微生物及其在口腔疾病的关系研究中提供了快捷高效的技术手段，使人类对口腔菌群的了解深入到新的层面。因此本文就迄今使用高通量宏基因组学技术对牙髓病和根尖周病相关微生物群的研究进行一综述。1.牙髓病1.1牙髓感染根管内微生物群研究牙髓病主要是由口腔微生物群失衡引起的炎症性疾病，临床上依据其患牙症状将其分为可复性牙髓炎、不可复性牙髓炎（慢性牙髓炎、急性牙髓炎）、牙髓坏死等。最新的微生物群落16SrRNA高通量测序发现牙髓炎感染根管内存在16种细菌，1种真菌（

5、白色念珠菌）和1种病毒（单纯疱疹病毒）。其中，细菌总体上以革兰氏阴性厌氧菌为主，检出率最高的物种依次是隐球菌（68.3%）、牙龈卟啉单胞菌（58.8%）、唾液链球菌（58.5%）和齿密螺旋体（56.1%）。随着牙髓状态和患牙症状的改变，根管内的菌群多样性、分布和组成均发生显著的改变。不可逆性牙髓炎无根尖周炎（periapical，PA）病损组和牙髓坏死伴PA病损组中检出率最高的物种是隐球菌（分别为75%和76.5%），不可逆牙髓炎伴PA病损组中是福赛斯坦纳菌（75%），牙髓坏死无PA病损组中则是牙龈卟啉单胞菌（75%）和牙螺旋体（75%）。这些结果提示从牙髓炎发展到完全坏死过程中，由于宿主防御

6、能力以及环境条件等相互作用下根管内微生物组呈现动态的变化。1.2牙髓炎相关龋洞内感染情况龋病是引起牙髓病最常见的病因之一，致病微生物通过暴露的牙本质小管或髓腔进入根管感染牙髓。学者通过16SrRNA高通量测序发现龋性牙髓炎龋洞内微生物群落由14个细菌门、101个细菌属、706个不同的可操作分类单元（operationaltaxonomicunit，OTUs）组成，呈现出复杂的物种多样性；在门水平上，其主要由厚壁菌门，放线菌门和变形菌门组成，共约占总序列的98%；在属水平上，其最常见的物种是乳杆菌属（42.3%），其次为奥尔森氏菌（13.7%）、假分枝杆菌（10.7%）和链球菌（5.5%）。不可

7、复性牙髓炎的微生物分布与正常牙髓以及可复性牙髓炎之间有显著差异，其乳酸杆菌的相对丰度明显高于其他组。龋菌群鉴定有可能成为牙髓炎的辅助诊断方法。值得注意的是，龋洞深层的微生物菌群与牙髓病临床症状存在一定相关性。Sun等发现-杆菌的相对丰度与疼痛、电活力测试呈显著负相关关系，放线菌和丙酸杆菌的相对丰度与临床诊断呈显著负相关；而乳酸菌的相对丰度与指诊疼痛、冷测试验、叩诊反应和临床诊断呈显著正相关。在另一项研究中，Rocas等发现链球菌属，隐形双球菌和微小芽孢杆菌与搏动痛、变异链球菌与叩痛、乳酸菌与持续痛均呈现显著正相关。这些结果提示龋洞内微生物群落特征研究可为龋性牙髓炎病因学研究、疾病诊断和预警提供

8、新策略提供新思路、新方法。2.根尖周病根尖周病是由于根管内存在感染以及病原刺激物而导致的根尖周组织的炎症反应。临床上对根尖周病的分类方法较多：依据患者的临床症状，可将其分急性根尖周炎慢性根尖周炎；依据疾病的病理特征，可将其分为根尖周囊肿、根尖周脓肿、根尖周肉芽肿；依据疾病治疗前后，可将其分为原发性根尖周炎和继发性/持续性根尖周炎。不同于牙髓病，根尖周病致病微生物及其毒素不再局限于根管内，治疗过程中未完全清理的根管内及根尖孔外生物膜，以及唾液污染带入根管内导致的新感染在难治性根尖周炎的发生、发展过程中具有重要地位。其中，根尖区微生物可以在根尖孔外表面定植，造成继发感染，成为难治性根尖周炎迁延复发

9、的主要原因。因此，下文将从根管内和根尖周两个部位来综述根尖周病相关的口腔微生物宏基因组学研究。2.1根尖周病根管内微生物群落特征根尖周病多继发于牙髓炎，其感染根管内菌群的物种多样性较高。Hong等利用16SrRNA测序发现，牙髓炎感染根管内微生物群落包括10个细菌门、148个细菌属、803个OTUs，常见物种包括放线菌属，梭杆菌属，螺旋体，类细菌菌属，厚壁菌属，普雷沃菌属，水解菌属等。相对于未治疗的感染根管，治疗后持续感染或者再感染的根管内环境发生改变，微生物菌群多样性存在一定差异，主要表现在特定菌属组成不同：在门水平上，变形菌门和无壁菌门在继发感染根管中显著增加，相对丰度较低的蓝藻和酸杆菌则

10、在持续感染根管中显著富集；在属水平上，乳酸杆菌、链球菌和鞘氨醇单胞菌等14菌属在持续感染根管内显著增加。此外，粪肠球菌作为引起难治性根尖周炎的主要致病菌，在继发感染根管内检出率更高。但是，也有部分研究认为原发性根尖周炎和继发性/持续性根尖周炎的感染根管内微生物菌群无显著差别。如Hong等研究发现原发性根尖周炎和继发性/持续性根尖周炎的感染根管内最高丰度的物种均是拟杆菌门，且两者的微生物群落多样性、结构和组成均无显著统计学差异；Keskin等研究结果亦与之类似，发现两者由15个细菌门、160个细菌属、368个细菌种组成，且微生物菌群的多样性和丰富度菌无显著性差异。总体来说，继发性/持续性感染的根

11、管和原发性根管一样，其微生物群落具有高度的多样性和复杂性。与牙髓病相似，根尖周病感染根管内微生物群落特征与临床症状之间也存在相关性，主要表现在菌群物种的种类和数量上，有症状的感染根管内微生物群落多样性显著高于无症状者。Nbrega等等发现急性根尖周脓肿感染根管内常见物种包括：在门水平上，硬壁门（43.5%），拟杆菌（22.5%）和变形菌（13.2%）。这与Santos等研究结论相一致，该学者发现在门水平上，急性感染根尖周炎患者根管内微生物菌群以硬壁菌（52%）、梭杆菌（17%）和类杆菌（13%）为主，而慢性感染者则以硬壁菌（59%）、类杆菌（14%）和放线杆菌（10%）为主；在属水平上，急性者

12、主要由梭杆菌属（19%）和细小单胞菌属（11%）组成，且梭杆菌成员在急性组（89%）比慢性组（50%）中更为普遍存在。有学者研究继发性根尖周炎有症状和无症状者相关根管微生物菌群时发现，厚壁菌和梭杆菌在有症状组中显著富集，而变形菌和放线菌在无症状组中显著富集。此外，Snchez-Sanhueza等对24例接受根管再治疗的根尖周炎患者的根管内菌群进行16SrRNA高通量测序检测发现，根尖周指数（periapicalindex，PAI）评分5的根管内微生物菌群多样性显著高于PAI指数为4者。2.2根尖周病中根尖区微生物群落特征根尖周病的进程取决于微生物菌群和宿主免疫系统之间的相互作用。因此，感染根管

13、尖端及根尖周组织内微生物群落在根尖周炎的发病机制中至关重要。Siqueira等对根尖周病变患牙进行拔除或根尖手术切除后，采用16SrRNA高通量测序技术检测根尖区微生物发现，感染根尖周区微生物菌群具有高度的物种多样性特征，由10细菌门、84个细菌属、187个细菌种组成，其中优势门包括变形菌门、厚壁菌门、放线菌门，梭杆菌门和拟杆菌门等。2016年Siqueira等再次对10颗经根管治疗后仍患有持续性根尖周炎的牙齿根尖标本微生物群落进行研究，亦发现85%以上的序列仍属于以下4个细菌门：变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和放线菌门，其中变形菌门是最高丰度的物种；14个细菌属可在所有样本中被检测到，其中梭杆

14、菌属和假单胞菌属是优势菌属，持续性根尖周炎得到充分治疗后患牙根尖区仍然存在高度复杂的微生物群落。相对于根尖区硬组织菌群系统的研究，根尖区软组织的研究则鲜有报道。Mussano等针对根尖肉芽肿和根尖囊肿软组织内菌群进行16SrRNA高通测量研究，结果发现根尖肉芽肿和根尖囊肿共有的核心OTUs以兼性厌氧菌为主，如乳酸乳球菌、痤疮丙酸杆菌、金黄色葡萄球菌、约氏不动杆菌和孪生菌；根尖肉芽肿组中乳酸乳球菌含量明显高于根尖囊肿组，根尖囊肿组富集更多的厌氧微生物，且更多参与脂多糖生物合成相关的代谢途径。此外，根尖周区微生物菌群与感染根管者类似，主要由厌氧微生物构成。Ozok等学者对比分析慢性根尖周炎根管上段（冠部组）和根管尖端（尖端组）的微生物菌群发现，根尖组微生物菌群多样性明显高于冠部组；一些属于专性厌氧菌的分类群在根尖部分明显比冠部丰富，如尖端组中显著富集变形菌，而冠部组则富集放线菌。Persoon等同样将26颗原发性根尖周炎分根尖区和根管冠部进行微生物菌对比分析，共鉴定出338个细菌OTUs、28个内部转录间隔1区（internaltranscribedspacer，ITS）的OTUs、24个ITS2OTUs，但根尖区和冠方根管的微生物菌群分布没有差异。3.结语高通测量技术使我们对牙髓病以及根尖周病相关微生物多样性以及结构的认识有了很大的提高感染根管内存在