干细胞与组织工程：Hematopoietic Stem Cell and HSCT

1、Hematopoietic Stem Cell and HSCTHematopoietic Stem Cell (HSC) 主要存在于造血器官的、具有自我更新（self-renewal）和多向分化潜能（multi-differentiation）,能够分化发育为各种外周血细胞的幼稚细胞。HSC的起源的起源(yolk sac)羊膜囊羊膜囊绒毛绒毛体蒂体蒂上胚层上胚层卵黄囊卵黄囊胚外中胚胚外中胚层层胚外体腔胚外体腔绒毛膜绒毛膜下胚层下胚层卵黄囊卵黄囊(yolk sac) 是位于胚体腹侧包围在卵黄外的具有丰富血管是位于胚体腹侧包围在卵黄外的具有丰富血管的膜囊。的膜囊。 鸟类卵黄囊随胚体的增长及卵黄的

2、消耗而逐渐鸟类卵黄囊随胚体的增长及卵黄的消耗而逐渐萎缩，最终被吸收，形成小肠的一部分。萎缩，最终被吸收，形成小肠的一部分。 第第5周末人胚胎卵黄囊与原肠断离，逐渐退化，周末人胚胎卵黄囊与原肠断离，逐渐退化，至第至第7周成为小于周成为小于5毫米的小囊，残存于胎盘表毫米的小囊，残存于胎盘表面。面。 人卵黄囊上的胚外中胚层在第人卵黄囊上的胚外中胚层在第3周形成血岛，周形成血岛，是胚胎最早形成是胚胎最早形成血管血管和和血细胞血细胞的部位的部位 胚胎原始生殖细胞胚胎原始生殖细胞最早也出现于卵黄囊壁，最早也出现于卵黄囊壁，骨髓与血窦骨髓与血窦HSC NichesHSC NichesHSC NichesDe

3、velopment of HSC胚胚 胎胎 全全 能能 干干 细细 胞胞 ESC） 造造 血血 干干 细细 胞胞 骨髓骨髓 基基 质细质细 胞胞 成纤维细胞 脂肪细胞 巨噬细胞 内皮细胞 网状细胞 外外 胚胚 层层 干干 细细 胞胞内内 胚胚 层层 干干 细细 胞胞 中中 胚胚 层层 干干 细细 胞胞 间间 充充 质质 干干 细细 胞胞 Mesenchymal Stem Cell ( M S C ) 间间 充充 质质(祖祖) 细细 胞胞 Mesenchymal Cells (MC) SH 2 / 3 / 4 (+) CD 13, 29, 44, 50, 54, 73, 90, 105, 106

4、, 166 (+) CD 34, 133, 45, 33, 2, 3, 4, 8, 14, 15, 16, 19, 20, 24 ( - ) 成骨细胞 血管平滑肌细胞 软骨细胞 血管外层细胞 肌腱细胞 血管内皮细胞 The differentiation and maturation of HSC HSC HPC Precursor Matured blood cellHSC:主要存在于造血组织中，具备分化主要存在于造血组织中，具备分化 为各种血细胞潜能的原始细胞为各种血细胞潜能的原始细胞 PHC 造血祖细胞（造血祖细胞（ hematopoietic Progenitor Cell (HPC)

5、 precursor cell 造血前体细胞造血前体细胞 形态可辨形态可辨Development of HSCCharacteristics of HSC 1. Self-renewal (or self-maintenance) Concept dormancy(G0 phase) cell cycle Proliferation Proliferation differentiation 1个HSC经过1719次分裂，可形成170 000720 000个成熟的血细胞Characteristics of HSC 1. Self-renewal (or self-maintenance) di

6、fferent HSC has different self-renewal abilities 脾结节连续移植实验 骨髓连续移植实验 体外集落转移分析 Characteristics of HSC2.multiple differentiation Concept About Differentiation multiple differentiationCharacteristics of HSC2.multiple differentiation Characteristics of DifferentiationHSC HPC Precursor,matured blood cells

7、 Multiple limited noneCharacteristics of HSC 3.其他特征 形态学上难于辨认 高度静止90% - 99.5%处于G0期 高度不均一，存在“年龄” 结构 HPC multipotential haemetopoietic progenitor cell (mHPC) HPC committed haemetopoietic progenitor cell (cHPC)mHPC and cHPC LTC-IC(long-term culture-initiating cell HPP-CFC(high proliferative potential mH

8、PC colony-forming unit) CFU-mix(35 cell lineages) mHPC more than 3 cell lineages limited self-renewal (secondary colony transplantation) mHPC and cHPC BFU-E(burst forming unit-erythrocyte) CFU-E (colony forming unit-erythrocyte) CFU-G(colony forming unit-granulocyte) cHPC CFU-GM(colony forming unit-

9、 granulocyte-macrophage) CFU-Meg(colony forming unit- megakaryocyte) CFU-TL,CFU-BL(T,B-Lymphocyte)mHPC and cHPC Summary Differentiation: multiple cell lineage limited cell lineage single cell lineage . Accordingly, the self-renewal ability would be limited mHPC and cHPC Summary Proliferation: the ea

10、rlier the HPC is, the stronger proliferative ability it has, the bigger its colony would be. Accordingly, the longer the colony can be seen,the fewer the colony number would beDifferences between HSC and HPC HSC: unlimited self-renewal ability HPC: limited self-renewal ability (HSC,G0 phase) HSC HSC

11、 HPC maturedMolecular marks of HSC CD(Cluster of differentiation)（白）细胞分化白）细胞分化抗原，在细胞的不同发育阶段出现抗原，在细胞的不同发育阶段出现 CD34+ HSC CD38- lineage- (lineage specific antigen, 系别抗原，某个系列细胞共有的系别抗原，某个系列细胞共有的 抗原抗原, 如，粒系为如，粒系为CD11，13， 15， 16； B淋巴系为淋巴系为CD19，20，21， 22；红系为红系为CD47，59，71；）人造血干祖细胞的表型人造血干祖细胞的表型 (1) 干干 细细 胞胞 祖

12、祖 细细 早期早期 胞胞 晚期晚期CD 34 + + + + +Thy-1 + + + C-kit + + +AC-133 + + CD 33 + +CD 38 + +CD 45RO + + + 干干 细细 胞胞 祖祖 细细 早期早期 胞胞 晚期晚期Lin: + +(G) CD 11, 13, 15, 16 + +(M) CD 12, 14 + +(T/ NK) CD 2, 25, 7, 56, 45RA + +(B) CD 19, 20, 21, 22, 45RB + +(Mk) CD 31, 41, 42, 61, 107 + +HLA-DR + + + 人人 造造 血血 干干 祖祖 细细

13、 胞胞 的的 表表 型型 (2)造血干细胞的检测造血干细胞的检测- 至今尚无与体内重建造血法完全吻合的造血干细胞体至今尚无与体内重建造血法完全吻合的造血干细胞体外检测法外检测法 体外用多参数法：体外用多参数法：CD34+， 38 ,33，45RO 临床移植成功后供者标志在受者体内维持一年以上为临床移植成功后供者标志在受者体内维持一年以上为干细胞植入干细胞植入 在在NOD-SCID(nonobese diabetic-severe combined immunodeficiency disease)小小鼠植入，外周血长期出现人类髓系和淋巴系细胞，证鼠植入，外周血长期出现人类髓系和淋巴系细胞，证实

14、为人类干细胞植入实为人类干细胞植入 人绵羊嵌合实验人绵羊嵌合实验HCS的检测方法的检测方法CFU-S AssayHematopoietic Colonies造血干细胞移植造血干细胞移植(HSC Transplantation,HSCT) 将富含造血干细胞血液输入经特殊将富含造血干细胞血液输入经特殊处理的受体（患者），以期重新建立受处理的受体（患者），以期重新建立受损的造血系统和免疫系统或矫正异常造损的造血系统和免疫系统或矫正异常造血的过程。血的过程。 hematopoietic reconstitution immunological reconstitutionHSCT的适应症的适应症 血液

15、系统恶性肿瘤血液系统恶性肿瘤 造血衰竭性疾病：造血衰竭性疾病：AA，MDS等等 非血液系统恶性肿瘤非血液系统恶性肿瘤 其他：放射病，遗传病，自身免疫性疾病其他：放射病，遗传病，自身免疫性疾病, 基因治疗载体基因治疗载体;AIDS?等等 HSCHSC移植分类移植分类一、根据一、根据HSCHSC来源分类来源分类1 骨髓移植（BMT） 2 外周血造血干细胞移植（peripheral blood peripheral blood hematopoietic stem celltransplantationhematopoietic stem celltransplantation，PBHSCTPBHS

16、CT）3 脐带血造血干细胞移植（CBHCST）4 CD34细胞移植（CD34 T）二、根据供者分类二、根据供者分类1 同基因同基因(synogeneic) 2 异基因异基因( allogeneic) 3 自体自体 （autologous）HSC移植分类移植分类三、根据预处理的方法分类三、根据预处理的方法分类1 清除骨髓性干细胞移植（清除骨髓性干细胞移植（MSCT） Myeloablative stem cell transplatation2 非清除骨髓性干细胞移植（非清除骨髓性干细胞移植（NSCT） Nonmyeloablative stem cell transplatationHSCHS

17、C移植分类移植分类HSCT的基本过程 BMHSC 组织配型：组织配型： ABO血型；血型；HLA 术前准备：术前准备：健康检查；遗传病、传染病筛查健康检查；遗传病、传染病筛查 自体输血准备：自体输血准备：备用自体血备用自体血600ml800ml; 麻醉：麻醉：连续硬膜外麻连续硬膜外麻 采骨髓：采骨髓：髂前后上棘、胸骨穿刺髂前后上棘、胸骨穿刺 保存液：保存液：肝素肝素+RPMI1640/TC199HSCHSC采集采集HSC采集 PBHSCT1、HSC Mobilization： 正常成人正常成人PBSC占外周血液单个核细胞的占外周血液单个核细胞的1左右，经左右，经适当动员处理可提高至适当动员处理

18、可提高至10 ;动员剂动员剂HSCHSC采集采集肿瘤化疗药物：肿瘤化疗药物：如环磷酰胺、马利兰、如环磷酰胺、马利兰、柔红霉素、阿糖胞苷等柔红霉素、阿糖胞苷等造血细胞刺激因子：造血细胞刺激因子：G-CSF、M-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-6和和SCF等等 HSC Mobilization： 动员方法：动员方法：于PBSC单采前5d，皮下注射重组细胞集落刺激因子，如G-CSF2.55.0g/（kg.d）；采集当天皮下注射较高剂量重组细胞集落刺激因子（如G- CSF5g/kg），直至白细胞总数达20109 9/L，血小 板达20109 9/L后，静脉推注地塞米松10mg后1-2h 开始单采

19、外周血造血干细胞一般需单采5-7次，每次均须计数单个核细胞总数，测定CD34+ +细胞百分率 HSCHSC采集采集 HSC Collection: 设备：设备：CS-3000plus; MSC+血细胞分离机；血细胞分离机；抗凝剂：枸橼酸枸橼酸钠葡萄糖（抗凝剂：枸橼酸枸橼酸钠葡萄糖（ACD）采集量：采集量：MNC采集量约采集量约2108/Kg体重，体重，MNC总数约总数约121010, 血液总体积血液总体积50100mlHSCHSC采集采集血细胞分离血细胞分离HSC保存与运输保存与运输 非冷冻保存非冷冻保存: 1、冷藏保存：、冷藏保存：肝素抗凝肝素抗凝,加适量加适量TC199培培 养液养液,4保存保存, 尽早使用尽早使用,最高期限最高期限7天天; 超过超过3天效果较差。天效果较差。 2、培养保存：、培养保存：假如足够营养成分，假如足够营养成分，33 37 孵箱培养保存孵箱培养保存 HSC 成熟度高，生存期短；成熟度高，生存期短； 原始程度越高，存活期越长原始程度越高，存活期越长。 冷冻保存冷冻保存 1、预处理：、预处理： 去脂肪：去脂肪：BMHSC静置或离心去脂肪；静置或离心去脂肪； 去红细胞：去红细胞：CS3000，Cobe离心分离；离心分离；羟已基淀粉沉淀羟已基淀粉沉淀RBC，洗涤；，洗涤； 淋巴细胞分离液离心分离；淋巴细胞分离液离心分离； 去去T细胞：细胞：Mab处