固相萃取(SPE)技术的介绍和实际应用.

1、固相萃取（SPE）技术固相萃取技术SPE 一概述二SPE基本原理三.SPE法的优点四.SPE装置五SPE的类型 7a. SPE方法的建立七.SPE的应用概述所谓萃取法，就是从样品中提取组分，传统的 方法是液液萃取法（LLE），即用液体作为提取 剂；我们这里探讨的SPE ,是用固体物质作为萃 取剂，采用高效、高选择性的固定相进行萃取 的样品预处理技术。SPE技术自上世纪70年代后期问世以來，发 展迅速，广泛应用于环境、制药、临床医学、 食品等领域。一 概述借助SPE所要达到的目的是：（1）从试样中除去对以后的分析有干扰物质；（2）富集痕量组分，提高分析灵敏度；（3）变换试样溶剂，使之与分析方法想

2、匹配； （4）原位衍生；（5）试样脱盐。使用SPE方法，要尽可能避免柱因超载而被穿 透，从而影响分析结果的准确性。概述样品类型Survey response %SPE可以用于所有类型样品的处理，但是液 体样品是最容易处理的。 Liquids Solid Goos and creams Gaseous口 Other二SPE基本原理SPE是一种吸附剂萃取，样品通过填充吸附 剂的一次性萃取柱，分析物和杂质被保留在柱 上，然后分别用选择性溶剂去除杂质，洗脱出 分析物，从而达到分离的目的。SPE的分离模式主要取决于填充剂的类型和 溶剂的性质。二SPE基本原理SPE也是一个柱色谱分离过程，分离机理、 固定

3、相和溶剂的选择等方面与高效液相色谱 (HPLC)有许多相似之处。但是SPE柱的填料粒径(40pm)要比HPLC 填料(310pm)大。由于短的柱床和大的粒 径,SPE柱效比HPLC色谱柱低得多。因此，用SPE只能分开保留性质有很大差别 的化合物。与HPLC的另一个差别是SPE柱是一次性使用。三.SPE法的优点(1)简单、快速和简化了样品预处理操作步骤， 缩短了预处理时间。-(2 )处理过的样品易于贮藏、运输，便于实验室 间进行质控。 (3 )可选择不同类型的吸附剂和有机溶剂用以 处理各种不同类的有机污染物。 (4)不出现乳化现象，提高了分离效率。-(5)仅用少量的有机溶剂，降低了成本。 (6)

4、易于与其他仪器联用，实现自动化在线分析。四.SPE装置Sorbent bedLuer tipnShrink-wrappednpolypropyleneCleaned polyethylene frits五.SPE的类型在SPE法中最常用的吸附剂是硅胶或键合相 的硅胶即在硅胶表面的硅醇基团上键合不同的 有机基团，如烷基链或其它官能团，女口OH、 c6h5 -nh9 -CN等。实际上吸附剂角色是由 这些新接上的含官能基碳链來完成。以硅胶为基质的吸附剂主要有以下优点：粒径（e.g.40pm）、孔径（e.g.60A）、表面积 （600m2/g）、键合量易控制；机械强度高；化 学性质稳定；适应性广；可使

5、用的溶剂种类多。X22. Rcprcscnuition nn unboruictl silica particle. (Reprinted with permission fram Ref. R4. Copyri&hi 占 2002 Waters (orpomtion.)五.SPE的类型硅胶表面的官能团SiOHSi-OH -Free silanol chAdsorbedun2 waterOHSiOHGeminal silanollSiloxa neSi-O0 obridgeBound andY /(dehydratedH reactiveSiZsilanol)SiO；silanolsH五.SP

6、E的类型依据柱中填料（吸附剂）来划分，可将SPE法分为吸附型和键合相分配型（BPC） o吸附型SPE是采用极性较强的硅胶、硅藻土 和氧化铝等吸附剂，样品进入柱中，分析物的 极性官能团先迅速被吸附至极性吸附剂上，而 后以低极性溶剂转至中极性溶剂陆续洗去杂质 及洗脱出分析物。五.SPE的类型以硅胶为基质的固定相的分类SPECIALTY PHASESION-EXCHANGE PHASESNON-POLAR PHASESC18OctadecylC2EthylCHCyclohexylPHPhenylPOLAR PHASESCN Cyanopropyl 20H DiolNH2 Aminopropyl SI

7、 SilicaPBA CERTIFY ENVIRELUT ACCUCATCXBAAXH2SCSNStrong cation exchanger Weak cation exchanger Strong anion exchanger Weak anion exchangerH 的类型严輙鮒彌礙的I填充剂使用非极性烷姪类化学键合相（C18、C8、 C6H5-C6H!等）的SPE分离方式称为反相BPCo最适 用于极性基质中萃取非极性化合物。当样品溶液通过萃取柱时，杂质不被保留，直接通 过柱子除去，只有分析物保留在柱上，只要选用一 种合适的洗脱溶剂既可将其从柱上洗下。五.SPE的类型硅胶键合极性固定

8、相填充剂使用极性键合固定相（-nh2 -cn -2OH等官能团）的SPE分离方式称为正相BPCo其对极性分析物的吸附力不及分配型SPE大，故洗脱 容易。在实际使用中，先以非极性溶剂清洗管柱， 继而加样，分析物立刻会被吸附，然后以非极性溶 剂洗去杂质，最后以极性溶剂洗脱分析物。讥.SPE的类型.分析物与极性固定相的作用力Dipolar attract!on or hydrogen bonding硅胶键合离子交换剂填充剂为硅胶基质的离子交换官能团有：季胺、 氨基、二氨基、苯磺酸基、竣基等。此外常用的还有聚合物，如苯乙烯而乙烯苯共 聚物XAD-2及PRPJ等。相对于键合相填料，聚合 物可适用于全部p

9、H范围，因而应用广泛。对于酸性化合物，如有机酸、无机阴离子、酸性 蛋白等，一般采用阴禽子交换SPE柱；对于碱性化合物，如有机胺、金属离子、儿茶酚胺和碱性蛋白等，采用阳离子交换SPE柱。(a) benzenesulfonic acid-modified silica sorbenteo-二s(b) trimethylaminopropyl-moditied silica sorbentFigure 2.28. Interactions between analytes and ion-exchange sorbents:何 strong cation- exchange sorbent and

10、(b strong anion-exchange sorbent硅胶键合离子交换剂Weak or Strong Acids/BasessexStrong anionPRSStrong anion, pKa 1CBAWeak anion, pKa 4.8SAXStrong cationPSAWeak cati on, pKa 10.9, 10.1NH2Weak cation, pKa 9.80.7meq/g0.3meq/g pH-se nsitive0.8meq/gpH-se nsitive pHsen sitive五SPE的类型OCON(CH3)2Electrostatic attractio

11、n基体对选择合适分离机制有着重要影响(e.g.)Matrix typeCompoundSuggested mechanismSaline solutionrNH2 Non-polarOlive oil2PolarDrinking waterIon exchange五.SPE的类型混合模式固定相S03-Hurc 2.32 Example of a mixed-mode sorbent consisting of silica nuxiiiied with octyl (C& alkyl chains and strong calion-exchangc sites bonded on the s

12、ame sorbent panicle.blendedstacked卜已urv 233 SPE multiplemodc approaches.六.SPE方法的建立SPE操作步骤包括有柱子类型的选择、柱预 处理、加样、洗去干扰物和回收分析物四个步 骤。在加样和洗去干扰物步骤中，部分分析物有 可能穿透SPE柱造成损失，而在回收分析物步 骤中，分析物可能不被完全洗脱，仍有部分残 留在柱上。最理想的情况是分析物100%地回收 到收集的组分中，但这并不是总能达到的。SPE柱子类型的选择 Is die sample matrix miscible primarily with water or orga

13、nic solvents? If the sample matrix is water soluble，is the analyte ionized or non ionized? If ionized, is the analyte permanently ionized (pH independent) or ionizable (pH dependent); is the analyte anionic or cationic? If the analyte is nonionized or ioniziilion can be controlled (by pH suppression

14、 or ion pairing), is it nonpolar hydrophobic), moderately polar, or polar (hydrophilic)? If the sample matrix is organic solvent miscible, is it miscible only in nonpokir organic solvents such as hexane, or is it also miscible in polar organic solvents such as methanol? Is the analyte nonpolar (hydr

15、ophobic), moderately polar, or polar (hydrophilic)?F igure 234 Method selection guide for the isolation of organic compounds from soluten. SAX, strong anion exchanger; SCX, strong cation exchanger; WCX weak cation exchanger： RP, reverse d ph use sampling conditions; NP, normal-phase sampling conditi

16、ons; IE, ion- cxchange sampling conditions. (Reprinted wilh permission from Ref. 77. Copyright 2000 Elsevier Science.)able 2.6. SPE Sorbcnt-Analvte Interaction MechanismsPrimary Interaction MechanismSorbentsEnergy of Interaction41 (kcal/mol)Van der WaalsOctadecyl, octyl, ethyl, phenyl, cyclohexyl, s

17、tyiene-divinylbenzene. graphitized carbon1-10Polar/dipole-dipoleCyano silica, alumina Horisil1-1()Hydrogen bondingAmino, diol5-10ElectrostaticCation exchange, anion exchange5O-2IX)4 Data from Ref. 97.1、Reversed-phase bonded silica sorbents having alkyl groups such as octadecyl (CI & Cl8), octyl (C&

18、C8), or ethyl (C2, C2) covalently bonded to the silica gel backbone or cyclohexyl (CH) or phenyl groups and sorbents composed of polymeric resins such as polystyrene divinylbenzeneinteract primarily with analytes via van dor Waals forces2、Nonionic watersoluble compounds can be retained by reversed-p

19、hase sorbents but may not be as well retained as analytes that are soluble in methanol or mcthanol-water miscible mixtures.3、Normal-phase polar sorbents, such as silica, alumina, and Florisil, and cyano (CN) bonded phases interact by polar-dipole/dipole forces between polar functional groups in the

20、analyte and the polar surface of the sorbent.4、Amino (NH2) and diol sorbents interact with analytes by hydrogen bonding5、Hexane-soluble analytes are best retained by normalphase sorbents such as silica or Fiori si 1 or polar functionally substituted bonded phases such as amino or diol6、Strong cation

21、-exchange (SCX) and strong anion-exchange (SAX) sorbents in teract primarily through electrostatic attractions between the sorbent and the analyte7 Graphitized carbon sorbents exhibit both nonspecific van der Waals interactions and anionexchange, or electrostatic, attraction for analytes.1、Dependenc

22、e of Sorption on Sample pHIf a compound is ionizable, (he extraction will be pH dependent.1 igurv 235. iXpcnucnoc of SPu Mrption on sample pt I. Graphic bused on selected data from Ref. 111.28909070605040302020-MOP -B-MPEP -A- MBP -X- MPRP -MEP MMPMonomethyl (MMP), Monoethyl (MEP), Mono-n-propyl (MP

23、RP), Mono-n-butyl (MBP), Mono-n-pentyl (MPEP), Mono-n-octyl (MOP) Phthalates (邻苯二甲酸盐酯)2、Dependence of Sorption on Sample VolumeBreakthrough volume as the point at which 1% of the sample concentration at the entrance of the sorbent bed is detected at the outlet of the sorbent bed. The type and quanti

24、ty of sorbent, hydrophobicity and ionizability of the analytes, and sample volume and pH interactively determine the breakthrough volume. The breakthrough volume for a specific mass of sorbent can be established by either loading variablevolume samples of constant concentration or variable-volume sa

25、mples of variable concentration, in which case the latter comprises a constant molar amount loaded。Alternatively, methods exist for predicting the breakthrough volume.0050100150200volume (mL)Y- 4nitroaniline -e- 4-nitrophenol -A- phenol -o aniline0080604020bi ure X36 LXrpcndcncc of SHE sorption on s

26、ampk volume. J rap hie based on selected data from Ref. 114.六.SPE方法的建立柱预处理-Condition柱预处理有两个目的:一个目的是除去填料中可 能存在的杂质；另一个目的是使填料溶剂化，提高 回相萃取的重现性。填料未经预处理或者未被溶剂 湿润，能引起溶质过早穿透，影响回收率。对于非极性相和离子交换SPE柱使用的柱预处理 溶剂为易溶于水的甲醇、乙睛、四氢咬喃和丙酮。 通常还要用水或缓冲液洗去残留在柱上的有机溶剂。六.SPE方法的建立柱预处理-Condition对于极性的SPE柱，非极性溶剂适合用于预 处理过程。通常很少有人用极性溶

27、剂去处理 极性的SPE柱，因为极性溶剂会与键合相发生 作用，减少吸附剂的与样品作用的表面积。六.SPE方法的建立柱预处SI Why Condition?Conditioned sorbentUnconditioned sorbent六.SPE方法的建立加样.Load Sample预处理后，试样溶液被加至并通过SPE柱。在该 步骤，分析物及杂质被保留在吸附剂上。为了防止分析物的流失，试样溶剂强度不宜过高。 当以反相机理萃取时，以水或缓冲剂作为溶剂，其 中有机溶剂量不超过10% (V/V) o为克服加样过 程中分析物流失，可采用弱溶剂稀释试样、减少试 样体积、增加SPE柱中的填料量和选择对分析物有

28、 较强保留的吸附剂等手段。六.SPE方法的建立除去干扰杂质-Wash用中等强度的溶剂，将干扰组分洗脱下来，同时 保持分析物仍留在柱上。对反相萃取柱，清洗溶剂 是含适当浓度有机溶剂的水或缓冲溶液。通过调节 清洗溶剂的强度和体积，尽可能多地除去能被洗脱 的杂质。为了决定最佳清洗溶剂的浓度和体积，加试样于 SPE柱上，用510倍柱床体积的溶剂清洗，依次收 集和分析流出液，得到清洗溶剂对分析物洗脱廓形。 增加清洗溶剂强度，根据不同强度下分析物的洗脱 廓形，决定清洗溶剂合适的强度和体积。六.SPE方法的建立分析物的洗脱和收集-Elution这一步骤的目的是将分析物完全洗脱并收集 在最小体枳的组分山，同时

29、便比分析物更强保留的 杂质尽可罷多地仍常在SPE崔上。洗脱溶剂的强度是至关重要的。较强的溶剂 能够使分析物洗脱并收集在一个小体积的级分中， 但有较多的强保留杂质同时被洗脱下來。当用较弱 的溶剂洗脱，分析物级分的体积较大，但含较少的 杂质。为了提高分析物的浓度或要进行溶剂转换， 对以坦收慕到曲”析物级分用氮气吹干，再溶于小 体积送当的溶剂中。Wash solventElution solventSample matrixRetentionRinsingElution六.SPE方法的建立从SPE的操作步骤可以看出，SPE的重现性受多 个因素的影响，实验条件是影响重现性的主要原因。 提高重现性的方法

30、有（1）使用替代物，加入适当的替代物做参比；（2）加入样品量适当，不超出穿透量和穿透体积；（3）选择合适的洗涤液和洗脱液，确保分析物在操 作中不流失。七.SPE的应用非极性SPE柱OuJ 3Surrogate, vitamin K1 (25), con tains additi onal 1-methyl butyl group七SPE的应用非极性SPE柱 Condition: 2.0mL MeOH, l.OmL H2O Load Sample: 5OpiL serum, 30rL I.S., ImL H20 Wash: 2X l.OmL H0, dry under vacuum for 1 minute Elute: HPLC mobile phase AcCN/IPA/DCM (7:1:2 v/v) 2 X 150piL SPE柱:C8柱选择C8是因为维生素KI是亲脂性的,并且比C18 柱更易于洗脱下来，洗脱之前一定要除去柱上的水 分。分析仪器：HPLC-DAD检测器七.SPE的应用极性SPE柱Class Fractionation of a Lipid Mixture on NH2 Sorben