基因工程PCR技术课件

1、基因工程PCR技术Chapter 8 PCR technology基因工程PCR技术PCR polymerase chain reaction基因工程PCR技术Another cloning methodSelective amplification of a DNA sequence.In some situation, it essentially replaces traditional cloning methodology. 基因工程PCR技术PCR principlePCR: A technique to selectively amplify a specific region

2、of DNA. A method like DNA replication in vivo. template：ssDNA or dsDNAprimers：oligo-nucleotidessubstrates: dNTPDNA polymerase: Taq poly基因工程PCR技术 Basic principle：DNA thynthesing template/primer/DNA poly Application: themal-resistance DNA polymerase基因工程PCR技术DNA amplification PrincipledATP dGTP dCTP dT

3、TPMg2+buffer5335templateprimerDNA polymerase基因工程PCR技术denatureannealingextensiondsDNA ssDAN 92-96C37-72 C50-58 C72 C3Reaction基因工程PCR技术PCR reaction mixture1缓冲液 buffer (1) 50Mm (大于500bp) (70-100Mm , 小于500bp) KCl 引物退火 annealing 10mM TrisHCl pH 8.3-9.0 1.5mM MgCl2 (0.5-2.5) Stored in 20 基因工程PCR技术2. dNTP

4、Final concentration 0.2mM (即饱和浓度) pH7.0(浓度大于4mM可能抑制扩增反应) 4种dNTP 应平衡，提高忠实性 使用时应考虑Mg2+, 引物，产量之间的关系 如序列分析和制备探针时，用20-40m基因工程PCR技术3. Primers (正反向、同源互补、正反义)Each 1m(1pmol/l) OD260 dsDNA 50g/ml ssDNA 40g/ml oligo 33g/mlPrimer design 16bp, frequently 20-30bp Tm=81.5+16.61ogJ+0.41(G+C)%-(675/N) N: length of s

5、trand J: concentration of monovalent ion If N=20 G+C%=55% J+=60mmol/L then Tm=81.5-20.3+22.6-33.75=50.05基因工程PCR技术Tm=(G+C)4+(A+T)2 for short primers Operon 公司公司基因工程PCR技术 避免二级结构的形成 二聚体 二级结构 G/C和A/T分布尽量均匀,一般G+C%45-55% oligo dT /oligo dC 除外， 其它，如5末端，限制酶位点的长度 rondom primers 随机引物 6nt 10-12nt基因工程PCR技术4. Te

6、mplateg or ng 102 -1051g 人类单拷贝基因组DNA 3105 targets10ng yeast DNA 31051ng E.coli DNA 31051ng 1kb DNA 9 1061% M13 plaque 106基因工程PCR技术5. DNA polymerase 1-2U 早期使用klenow(1) Taq DNA polymerase, 75, 94kDaThermus aquticus 嗜热水生菌，水生栖热菌 5 - 3polymeration and 5 - 3 exonucleaseTaq half-time 2hr 92.5 40min 95 5min

7、 97.5基因工程PCR技术(2) Tth DNA polymeraseThermus thermophilus HB8, 94kDa,Mg2+: 5 -3合成DNAMn2+: 以RNA为模板合成cDNA可解决RNA反转录过程中形成的二级结构反转录: primer extension, cDNA合成基因工程PCR技术(3) DNA polymerase with 3- 5exonuclease and themal-resistanceA. Vent DNA poly (New England Blabs) Thermococcus litoralis, 85kDa Half-life: 1.

8、8hr at 100 (使用MgSO4) but Taq 5min基因工程PCR技术B. Tli DNA poly (Promega) 85kDa 来源同VentCPwoPyrococcus woesei (BM- Roche) 90kDaHalf-life 2hr at 100 1kb 55 24nt/sec 37 1.5nt/sec 72 500bp- 20sec, 1.2kb- 40sec if secondary structure, longer timeOther: after 10 cycles，increasing time for each extention 10”, 30

9、”, or 1基因工程PCR技术4cycles2535 Targets (起始模板) required cycles 3105 2530 (1ug 哺乳动物DNA) 1.5104 3035 1103 3540 50 4045Nf=N0(1+Y)nN0 :original copies， Nf :final copies，Y:extention efficiency，N:cyclesIf Nf = 1012 , Y=70% , N0 = 3105 , then n=28.6基因工程PCR技术Plateau effect平台效应在PCR反应后期, 产物的积累按减弱的指数速率增长(一般已积累到0.3

10、1pmol产物)原因: 底物浓度降低， dNTP or Primers dNTP or enzyme的稳定性 末端产物抑制(pyrophosphate焦磷酸, dsDNA) 非特异性竞争(非特异性产物or primer-dimer) 特异性产自身复性(10-8M) 高浓度产物下, 变性不彻底.基因工程PCR技术5Preparation of reaction solution(1) 常规 最后加酶,及矿物油(2) 具3-5活性酶A: template, primer, dNTP H2OB: buf, enzyme, H2O(3) 热起始 hot start下层:dNTP buf primer中

11、间:蜡珠(Ampli Wax PCR Qam100)上层: template (Taq)先加下层液,再一粒蜡株,70 10min 5 5min迅速加30l上层混合物基因工程PCR技术Application of PCR in gene cloningAdding RE sites1.Primer designing (引入酶切位点） 切点的类型 A 5：8 base序列，其中3-4为附加,4-6为酶切点，增加 引物 长度，但酶切效果仍然不好。 B 若内部序列为已知, 则根据需要，可进行5端突变设计， 效果更好切点的位置 参见限制性内切酶部分 如EcoRI, 5端有一个C, 在 2hr内可切割9

12、0% HindIII 5端有3个C, 在 2hr内可切割10% 20hr内可切割75%基因工程PCR技术Vector-T Taq酶特性：在平端双链DNA的3端添加1个A T载体：5端有1个T 效果好Blunt-end ligation 用Klenow大片段或T4 DNA聚合酶消去3端的突出 碱基，获得平端PCR产物 基因工程PCR技术Development of PCR（1） Nest PCR1st2nd基因工程PCR技术（2） A/T cloning PCR产物：Taq poly 产物的3末端 一般要在3末端加一个核苷酸,通常为A 载体 pGEM-T, pGEM-T Easy (promeg

13、a) pCR-3, pCR-II, pCR-3-Uni (半磷酸化)(Invitrogen) 核心 线性DNA基因工程PCR技术(3) 反向反向PCR (inverse PCR)“正向”“反向”基因工程PCR技术基因工程PCR技术(4) 长片段的长片段的PCR克隆克隆pH值变化，缓冲能力变化，以及锰离子的促裂解，模板和产物DNA被损坏；过长的分子变性困难；聚合酶与模板结合难；错误率增加，错误的碱基反过来导致聚合酶的失灵多用混合酶(如Pwo, Pfu) 来扩增基因工程PCR技术Taq Pwo Long sys0.9kb 1.1kb 2.9 4.8 6.3基因工程PCR技术科学出版社科学出版社 C

14、.W.迪芬巴赫迪芬巴赫 /G.S德维克斯勒，德维克斯勒，1998C CW WDieflenbach/G.S.DuekslerDieflenbach/G.S.Dueksler基因工程PCR技术（5）PCR-mediated mutaginesis(诱变诱变)PCR随机突变随机突变每循环Taq错配率在0.1210-4之间。20-25环后，每个核苷酸产生的累积错误率达10-3,但对于构建一个不同序列的变异库仍然不够，特别是1kb的片段。原因：普通条件下具较大定向错配即AT对变GC对。设计出一种致突变PCR法，使错误率达710-3，且无倾向性。基因工程PCR技术 Mg2+7mM Mn2+0.5mM 提

15、高提高dCTT/dTTT到到1 M，促进错误掺入，促进错误掺入 提高提高Taq酶量，促进延伸链在碱基错配位酶量，促进延伸链在碱基错配位 置继续延伸置继续延伸基因工程PCR技术PCR定点诱变定点诱变见见“定点诱变定点诱变”章节章节基因工程PCR技术（6）PCR detection and diognosis普通诊断普通诊断以一对引物或几对引物，加以对照，检测样品中的DNA的存在 医疗，商品，法医等位基因鉴定等位基因鉴定若多个相似基因共存，设计一系列引物对其进行鉴定，如 Bt crystal protein genes基因工程PCR技术(7) Molecular markers RAPD 随机扩增多态性随机扩增多态性DNA Random amplified polymorphic DNA AFLP 扩增片段长度多态性扩增片段长度多态性 Amplified fragment length polymorphism SSR simple sequence repeat 又称 微卫星DNA（