白毒鹅膏菌漆酶的产酶条件、酶学性质及用于染料脱色的研究作品申报书

1、序号： 编码： 第十届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛作品申报书 作品名称： 白毒鹅膏菌漆酶的产酶条件、酶学性质 及用于染料脱色的研究 学校全称： 山东大学威海分校 申报者姓名 （集体名称）： 山海联创 类别：自然科学类学术论文哲学社会科学类社会调查报告和学术论文科技发明制作A类科技发明制作B类报送方式：省级报送作品高校直送作品说 明1申报者应在认真阅读此说明各项内容后按要求详细填写。2申报者在填写申报作品情况时只需根据个人项目或集体项目填写A1或A2表，根据作品类别（自然科学类学术论文、哲学社会科学类社会调查报告和学术论文、科技发明制作）分别填写B1、B2或B3表。所有申报者可根据情

2、况填写C表。3表内项目填写时一律用钢笔或打印，字迹要端正、清楚，此申报书可复制。4序号、编码由第十届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛全国组委会填写。5学术论文、社会调查报告及所附的有关材料必须是中文（若是外文，请附中文本），请以4号楷体打印在A4纸上，附于申报书后，字数在8000字左右（文章版面尺寸14.522cm）。6发起高校的三件直送作品和各省（区、市）通过初评的作品（数量参照“作品数额分配方案”）各一式四份分别按全国组委会规定的时间用特快专递寄至全国竞赛组委会办公室。7作品申报书须按要求由各省或各校竞赛组织协调机构统一寄送。8其他参赛事宜请向本校竞赛组织协调机构咨询。9寄送地址：

3、南开大学团委第十届“挑战杯”全国大学生课外学术科技作品竞赛组委会办公室联 系 人：韩旭联系电话：（022）23508540传 真：（022）23508540邮政编码：300071A2申报者情况（集体项目）说明：1.必须由申报者本人按要求填写； 2.申报者代表必须是作者中学历最高者，其余作者按学历高低排列； 3.本表中的学籍管理部门签章视为对申报者情况的确认。申报者代表情况姓名于涛性别男出生年月1986.4学校山东大学威海分校系别、专业、年级海洋学院.生物科学.2004级学历本科学制4年入学时间2004.9作品名称白毒鹅膏菌漆酶的产酶条件、酶学性质及用于染料脱色的研究毕业论文题目无通讯地址山东省

4、威海市文化西路180号邮政编码264209办公电话无常住地通讯地址山东省威海市文化西路180号邮政编码264209住宅电话5674456其他作者情况姓 名性别年龄学历所在单位董翠玲女21本科山东大学威海分校海洋学院王方忠男21本科山东大学威海分校海洋学院徐国英女22本科山东大学威海分校海洋学院资格认定学校学籍管理部门意见以上作者是否为2007年7月1日前正式注册在校的全日制非成人教育、非在职的高等学校中国籍专科生、本科生、硕士研究生或博士研究生。是否 （部门签章）年 月 日院、系负责人或导师意见本作品是否为课外学术科技或社会实践活动成果。是否负责人签名：年 月 日B1申报作品情况（自然科学类学

5、术论文）说明：1必须由申报者本人填写；2本部分中的科研管理部门签章视为对申报者所填内容的确认；3作品分类请按作品的学术方向或所涉及的主要学科领域填写；4硕士研究生、博士研究生作品不在此列。作品全称白毒鹅膏菌漆酶的产酶条件、酶学性质及用于染料脱色的研究作品分类（D）A机械与控制（包括机械、仪器仪表、自动化控 制、工程、交通、建筑等） B信息技术（包括计算机、电信、通讯、电子等） C数理（包括数学、物理、地球与空间科学等） D生命科学（包括生物、农学、药学、医学、健 康、卫生、食品等） E能源化工（包括能源、材料、石油、化学、化 工、生态、环保等）作品撰写的目的和基本思路据最新资料统计，我国每年印

6、染废水排放量，占工业废水排放总量的35%，己成为危害最大的难以治理的重要污染源。许多染料在厌氧的环境下会转化为有毒物质或致癌物质，危害人类健康。由于染料自身特殊的化学结构，往往不能有效地被凝结、臭氧、活性炭等单一技术处理。生物处理法由于绿色环保、运行成本低，且可获得较高的脱色率，成为当前印染废水脱色研究的热点。漆酶又称酚酶,是一类可降解木质素的含铜多酚氧化酶。漆酶可以催化空气中的氧气直接氧化分解各种酚类染料、取代酚、氯酚、硫酚、双酚A、芳香胺等，由于它具有相当广泛的底物专一性和较好的稳定性，因此漆酶在治理含酚染料废水等方面有着巨大的应用前景。漆酶最早是从漆树的分泌物中发现的，随后人们发现一些高

7、等真菌也能分泌这种酶。最近，Givaudan等还从稻根分离出产生漆酶的细菌生脂固氮螺菌，但目前最主要的生产菌仍是一些大型真菌。本小组从资源调查入手，2006年暑假期间对威海玛珈山大型真菌进行了广泛采集和分离培养，又从所获得菌株中，进行漆酶高产菌株的筛选，获得高产菌株白毒鹅膏菌，并对其最适产酶条件进行了探讨，对白毒鹅膏菌所产漆酶进行了纯化和酶学性质研究，深入开展其在工业染料脱色降解方面的应用研究，发掘其在环境保护方面的巨大潜力，使之更好地造福社会。作品的科学性、先进性及独特之处本项目从资源调查入手，兼跨理论研究与应用研究三大领域；实验设计具有整体性，对漆酶研究具有系统性，研究内容紧扣学术热点。

8、关于白毒鹅膏菌漆酶研究在国内属首例报道；现已在国内核心期刊上发表多篇文章，实验成果得到认可；本作品就是在这几篇文章的基础上综合而来。作品的实际应用价值和现实意义1. 发现了非白腐真菌的漆酶高产菌株-白毒鹅膏菌，丰富了漆酶来源。2.诱导驯化了白毒鹅膏菌分泌漆酶的能力，提高了漆酶产量，以满足应用领域对漆酶的需求。2. 探讨了该种漆酶用于染料脱色方面的研究，为解决当前环境污染问题提供理论支撑。学术论文文摘从威海玛珈山上采集的9株夏季常见大型真菌中筛选出分泌漆酶能力最强的菌株白毒鹅膏菌。对其产漆酶最适培养条件、漆酶的分离纯化、动力学性质、对染料的脱色等方面进行了研究。培养与产酶条件的单因素和正交试验分

9、析表明：麸皮20g/L，酵母膏5g/L，装液量1/5，温度25，培养8d时产酶活达到最高，为365umL。经盐析、透析、纤维素离子交换和凝胶过滤四步纯化，粗酶液被纯化了22.03倍，比活率达230.59u/mg，酶活回收率达22.02%。测定了该酶的基本酶学性质，最适pH和最适反应温度分别为4.6和20，在pH5.0-5.4和低于60时有较好的稳定性，以邻联甲苯胺为底物的表观Km值为66.7mol/L；Ba2+、Cu2+、SO42-离子对漆酶有激活作用，而Ag2+、Cl、Fe3+离子则有抑制作用。研究表明白毒鹅膏菌漆酶能使7种工业染料脱色，其中直接黑G和中性黄GL在pH值为5、温度30条件下，

10、5U/mL的漆酶与直接黑G和中性黄GL反应的Km值分别为3.2mg/L和25.1mg/L，Vmax值分别为2.70mg/L*min 和3.25mg/L*min。作品在何时、何地、何种机构举行的会议上或报刊上发表及所获奖励文章白毒鹅膏菌漆酶动力学性质研究被吉林农业大学学报（全国中文核心期刊）录用；漆酶高产菌株的筛选及产酶条件的研究被河南工业大学学报（全国中文核心期刊）录用；白毒鹅膏菌漆酶部分酶学性质研究被石河子大学学报（省级重点期刊）录用。染料的白毒鹅膏菌漆酶脱色研究正在被沈阳理工大学学报（全国中文核心期刊）专家组复审；Purification and characterization of l

11、accase from the Amanita verna and decolorization of synthetic dyes by the enzyme已投稿。鉴定结果属实请提供对于理解、审查、评价所申报作品具有参考价值的现有技术及技术文献的检索目录1 E.I.SoLomon, U.M.Sundaram, T.E.Machonkin, Chem.Rev. 1996, 96: 2563-2605.2 J.M.Bollag, A.Leonowicz, Appl. Environ.Microbiol. 1984, 48:849- 854.3 S.C.Barton,H.-H.Kim,G.Bin

12、yamin,Y.Zhang,A.HeLLer,J.Am.Chem. Soc.2001, 123: 5802-5803.4 R.S.Freire, N.Duran, L.T.Kubota, TaLanta. 2001,54: 681-686.5 H.P.CaLL, I.Mucke,J. BiotechnoL. 1997, 53: 163-202.6 B.A.Kuznetsov,G.P.Shumakovich,O.V.KoroLeva,A.I.YaropoLov, Biosens.BioeLectron. 2001, 16: 73-84.7 A.M.Mayer, R.C.StapLes, Phyt

13、ochemistry. 2002, 60: 551-565.8 A.V.Karamyshev, S.V.ShLeev, O.V.KoroLeva, A.I.YaropoLov, I.Y. Sakharov, Enzyme Microb. TechnoL. 2003, 33: 556-564.9 朱启忠,赵宏，韩晓弟等.彩绒革盖菌CV一8胞外漆酶的诱导纯化及部分性质研究.生物技术.2005，15(l):13-15.10 王宜磊.高酶活菌株的筛选及漆酶特性.微生物学杂志.2004,24(l)：11-13.申报材料清单（申报论文一篇，相关资料名称及数量）申报论文一篇科研管理部门签章 年 月 日C.当

14、前国内外同类课题研究水平概述说明：1.申报者可根据作品类别和情况填写； 2.填写此栏有助于评审。近年来研究表明，漆酶具有广泛的作用底物和较好的稳定性；由于它能降解木质素,可与有毒的酚类物质作用,使苯氧基类除草剂、石油工业废水去除毒性,还可以氧化降解一些有机磷毒物,以及在微生物菌体形态形成和植物病原等方面的功能,使之在食品工业、环境保护、造纸工业及其它领域具有很大的研究价值和应用潜力。目前,漆酶的理论与应用研究已在生物、化学、物理、医学等多领域,分子、细胞、生物组织等多水平展开。1883年Yoshida最先从漆树叶中发现了漆酶(Yoshida H,1883),1894年Bertrand确定了它是

15、一种包含金属的氧化酶(Bertrand GCR,1894)。目前,在国外研究中许多漆酶已被纯化,并进行了大量的酶学研究（CLAUDIA E，1996）,编码漆酶的一些基因也已被克隆和表达（SMTTH N，1998）。我国最早研究漆酶的是刘国智、黄葆同等(刘国智，1958；黄葆同，1960)，它们于20世纪50年代末利用漆酶在催化反应中需要消耗氧气的特性，设计了漆酶的酶活测定方法。随后，直到20世纪80年代末，国内对于漆酶的研究一直停留在漆酶酶活的测定、漆酶表现特性的描述性研究上；与此同时，漆酶的分离纯化动力学特性和固定化的研究也开始起步。虽然真菌漆酶的研究与生产越来越受到人们的关注,但长期以来

16、,国内的研究工作主要围绕如何提高白腐真菌漆酶的产量而展开, 尤其针对彩绒革盖菌和毛栓菌漆酶的研究；而对其他非白腐真菌漆酶的研究，报道较少。这在一定程度上，大大缩小了开发利用漆酶的原料来源，限制了对该酶的开发利用。因此，有必要对其他非白腐真菌漆酶进行研究。经过筛选，我们发现了具有较高的分泌漆酶能力的非白腐真菌白毒鹅膏菌。在处理造纸废水方面,漆酶及能产生漆酶的真菌已显示出它特有的作用。氯化木素及其氧化产物是漂白废水颜色和毒性的主要来源（林鹿，陈嘉翔等，1997）。据J.Dec和J.M.Bollay研究发现（Dec J，Bollag J M，1990）,漆酶的去毒作用是通过酚的聚合反应实现的,漆酶可

17、催化氯酚生成低聚物,聚合产生的不溶性沉淀可以通过沉降、过滤去除,这样可以去除浓度高达1600 mg/ L 的取代酚。另外,研究表明（RoyArcand L , Archibald F S，1991）,各种真菌系统中的漆酶都能迅速地将许多有毒的多氯酚和愈创木酚部分脱氯,但22氯酚和42氯酚除外。与一般方法相比,采用漆酶处理造纸废液中有机氯化物,具有催化效能高,反应条件温和,对反应条件、反应设备的要求不苛刻等优点。D.推荐者情况及对作品的说明说明：1由推荐者本人填写； 2推荐者必须具有高级专业技术职称，并是与申报作品 相同或相关领域的专家学者或专业技术人员（教研组 集体推荐亦可）； 3推荐者填写此

18、部分，即视为同意推荐； 4推荐者所在单位签章仅被视为对推荐者身份的确认。推荐者情况姓 名张小葵性别女年龄46职称副教授工作单位山东大学威海分校海洋学院通讯地址山东省威海市文化西路180号邮政编码264209单位电话5688963住宅电话5688968推荐者所在单位签章 （签章） 年 月 日请对申报者申报情况的真实性作出阐述 所呈交的“挑战杯”参赛作品，是该团队在指导老师的认真指导下，独立进行研究所取得的成果。请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价 该作品具有源头创新性，发现新型漆酶高产菌株，实验技术水平高；所研究漆酶应用范围广，具有较大的开发潜力，推广前景广阔。其它说明 推荐

19、者情况姓 名吉爱国性别男年龄50职称教授.博士生导师工作单位山东大学威海国际生物技术研发中心通讯地址山东省威海市文化西路180号邮编264209单位电话5688526住宅电话推荐者所在单位签章 签章日期 年 月 日请对申报者申报情况的真实性作出阐述 该参赛作品，是在指导老师的认真指导下，该团队独立进行研究所取得的成果，真实可靠。请对作品的意义、技术水平、适用范围及推广前景作出您的评价 该作品系统性强，研究紧扣学术热点，整体创新性好；以解决水污染问题为基本出发点，具有较大的实际应用价值和较好的推广前景。其它说明学校组织协调机构确认并盖章 （团委代章） 年 月 日 校主管领导或校主管部门确认盖章

20、年 月 日 各省（区、市）评审委员会初评意见 评委签名： 年 月 日 各省（区、市）组织协调委员会审定意见 团 委 科 协 教 育 厅 学 联（签章） （签章） （签章） （签章） 年 月 日E全国组织委员会秘书处资格和形式审查意见组委会秘书处资格审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处形式审查意见 审查人（签名） 年 月 日组委会秘书处审查结果合格 不合格 负责人（签名） 年 月 日F参赛作品打印处G1全国评审委员会预审意见粘贴处G2全国评审委员会终审意见粘贴处真菌漆酶的研究进展宋瑞（安徽大学生命科学学院 合肥 230039）【摘要】漆酶是一种蓝色多铜氧化酶，和植物中的抗坏血酸氧化酶

21、，哺乳动物的血浆铜蓝蛋白属同族，能够催化多种有机底物和无机底物的氧化1,2，同时伴随分子氧还原成水。漆酶广泛分布于真菌、高等植物、少量细菌和昆虫中，尤其在白腐真菌中普遍存在。漆酶特有的结构性质和作用机理使其具有巨大的应用价值。本文就真菌漆酶结构，功能的研究进展作一综述，并对其应用作简单介绍。【关键词】真菌漆酶 三维结构 功能 应用1 真菌漆酶结构特征1.1 漆酶的组成漆酶是一种糖蛋白，肽链一般约由500个氨基酸组成3，糖基含量差异较大，占整个分子质量的10%80%4，据相关报道，漆酶的热稳定性可能与其糖基化有关。糖组成包括半乳糖、葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、氨基己糖和阿拉伯糖等。Mayer5认为漆

22、酶并不均一，它由多条50007000分子量的糖肽链基本结构单元组成。由于结构单元之间的缔合度不同，造成了各种漆酶分子量的不同。另外，分子中的糖基的差异，也会引起漆酶的分子量随来源不同会有很大的差异，从59390ku不等。真菌漆酶约含19种氨基酸，绝大部分为单体酶，但也有例外，如双孢蘑菇和长绒毛栓菌漆酶由两个亚基组成6，而柄孢壳漆酶I由四个亚基组成。漆酶种类繁多，不同种类的真菌产生的漆酶种类不同，即使同一种真菌在不同环境下也产生不同种漆酶。1.2 漆酶的晶体结构由于漆酶是含糖蛋白质，且糖质量分数较高，一直以来很难获得X-衍射分析所用的单晶体，因此阻碍了关于漆酶结构的研究进展。1998年第一个漆酶

23、晶体是Ducros V7制备的来自灰盖鬼伞(Coprinus cinereusv)T1Cu缺失型漆酶晶体，并分析了其结构。至今为止，Bacillus subtilis(CoA)8；Melanocarpus albomyces(MaL)9；Rigidoporus lignosus(RiL)10；Pycnoporus cinnabaricus(PcL)11；Coprinus cinereus(CcL)12和Trametes versicolor(TvL)13漆酶的三维结构已相继被报道。漆酶分子整体由3个杯状结构域所组成，分别称作结构域A、B、C，每个结构域主要由-折叠桶，-螺旋，loop结构所组成

24、。三者紧密结合形成球状结构。这是铜蓝蛋白家族所共有的结构形式7,9。分子当中含有二硫键，漆酶种类不同，二硫键数目也不一样，MaL漆酶分子由3个二硫键，分别是位于结构域A Cys4Cys12、结构域A和C界面上Cys114Cys540、结构域C Cys298Cys332，而CcL，RiL漆酶中则含有两个二硫键。在CcL漆酶分子中，由结构域A的Cys85和结构域B的Cys487形成一个二硫键，另一个二硫键存在于结构域A和结构域B(Cys117Cys204)之间。一个伸展的loop(氨基酸284327)连接结构域B和结构域C。Asn343上有N连接的N乙酰葡萄胺。1.3 漆酶的催化中心真菌漆酶分子中

25、一般都含有4个Cu原子，根据磁学和光谱学性质不同可将4个Cu原子分为三类：型Cu2+(T1Cu)和型Cu2+(T2Cu)各一个，都是单电子受体，呈顺磁性；型Cu24+(T3Cu)两个，是耦合离子对，是双电子受体，反磁性14。T1Cu位于结构域C上，T2Cu和T3Cu位于结构域A和C的界面上。漆酶绝大多数都只含4个Cu原子，Karhunen E等15研究的射脉菌( Phlebia radiata)漆酶却只含有2个Cu原子(T1Cu、T2Cu各一个)，无T3Cu原子，但该漆酶分子中含有1个具有类似T3Cu功能的有机小分子辅基吡咯喹啉(pyrroloquinolinequinone，PQQ)。Pal

26、mieri G等16从糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)中纯化的一种新型漆酶POXA1中含有1个Cu原子，2个Zn原子和1个Fe原子，由于缺少T1Cu，在610nm处没有吸收峰，酶蛋白呈白色。在不同种真菌漆酶分子中，与Cu原子相连的1个Cys和10个His及其周围的氨基酸配基则是相对保守的，这些氨基酸都分布在含有两对His的N末端区域，或是分布于C末端的Cys和其余结合铜原子的His之间。Cu离子构成了漆酶的活性中心，在漆酶催化氧化过程中起决定性作用，如果除去Cu离子， 漆酶将失去催化功能。1.3a T1Cu结合位点T1Cu形成单核中心接受来自底物的电子转移，具有典型的蓝铜谱带

27、，紫外可见光谱上600nm处有吸收峰，它是底物反应场所，把来自底物的电子传递三核中心铜原子上。T1Cu以Cu2+形式存在，在所有的漆酶中都与两个His的N原子和一个Cys的S原子配位结合，形成扭曲的四面体结构。有些多铜氧化酶还有第四个轴向的氨基酸配基，在不同的多铜氧化酶中配基种类不同，在抗坏血酸氧化酶中为Met，大多数其它真菌漆酶中通常为Phe，而灰盖鬼伞漆酶中为Leu，距离T1Cu 3.51，因此不能成为T1Cu的配基。这种配位的不同被认为可能引起真菌漆酶氧化还原电位升高。Perrycr等17认为此位置的还原电势强弱与其疏水基团大小成正比，如为甲硫氨酸(Met)配基，亮氨酸(Leu)配基，苯

28、丙氨酸(Phe)配基，其还原电势依次升高。然而Silvia Garavaglia等10通过比较CcL(低Eo)和TvL(高Eo)的不同发现，Leu或Phe不同的配位并不是导致氧化还原电位变化的最主要因素，认为T1Cu-NE间的距离则是影响氧化还原电位高低的主导因素。围绕在T1Cu一侧的是一个疏水性口袋，Leu462两边分别为Phe340和Phe398。T1Cu存在于Ile454的一侧，且位于一个约12宽、6深的凹陷中，结构域A和结构域C的三个loop构成了凹陷的表面。这个区域与还原底物的结合有关。这些伸展的loop区，决定了底物特异性，而真菌漆酶具有极度广泛的底物专一性，这可能是由于漆酶中缺少

29、这些区域，序列变异性也较大，且结合位点相对较大，再加上loop构象上存在的变化(表现在室温和100K结构之间的不同)的影响。1.3b T2/T3Cu结合位点T2Cu与T3Cu形成三核中心接受来自T1Cu单核位点的电子，与高度保守的四个His-X-His花样的8个His配位结合，T2Cu结合2个，每个T3Cu结合3个8,10。两个T3Cu之间结合漆酶的第二个底物氧分子。T2Cu具有电子顺磁共振效应，不易结合弱的配体，且不稳定，当螯合剂存在时，能够被一些2型耗竭(T2D)衍生物选择性还原去除；T3Cu的两个铜原子间偶联，其EPR性质消失，由于电子在OH和两个T3Cu之间的传递，在330nm处有特征

30、吸收带。另外，在400460nm间有一些小吸收带，推测是一些反应中间体，如氧/过氧中间体(PI)18,19，20。T2Cu与2个His和一个水分子或一个氯原子配位，形成T型几何结构21，这种结构对一价铜比二价铜更有利。在灰盖鬼伞漆酶晶体结构中，由于去除糖链导致T2Cu缺失，与抗坏血酸氧化酶相比，其构象发生些许变化。T3Cu对的两个Cu原子相距为5.3，而后者只有3.7；含氧的配基只结合T3Cu原子对中的一个，而且它在两个Cu原子间是不对称排列的，相距Cu3(a)和Cu3(b)分别为2.17和3.26；另外与其相似的是T2D漆酶（T2Cu被螯合，T1Cu和T3Cu保持完整），在T2D漆酶中，与T

31、2Cu配位的His399的咪唑环发生了旋转，因而能与T3Cu原子对中的一个Cu（距离2.5）配位；His399存在构象柔性，在1.68，100K结构中有两种构象，一种与抗坏血酸氧化酶和血浆铜蓝蛋白中的构象相对应，另一种是与T3Cu(a)配位的新位置。在100K时，两种构象比例为60:40，而在2.2室温结构中比例为80:20。总之，T3Cu(b)与His109、His66、His453配位，形成一个轻微扭曲的三角平面，距离氧桥3.26，距离T3Cu(a)5.1。T3Cu(a)有两种配位状态，一种是与His451、His111、His401的N和氧桥配位，距离分别为1.98、2.01、2.04和

32、2.17，犹如一个扭曲的四面体。另一种是Cu3(a)与旋转进入配位区的His399形成第五个配位，距离2.5。因此，T2D漆酶有两种构象，其平衡受温度变化和结晶条件的影响。不同来源漆酶的T2/T3Cu结合位点也有所差异，在Rigidoporus lignosus(RiL)中T3Cu的2个铜原子间无OH桥存在，相反T2Cu，T3Cu(a)则分别与1个OH相连，但由于与OH是不对称相连，所以不能认为是OH桥。然而，Bacillus subtilis(CoA)T3Cu的2个铜原子则是通过1个OH桥配位连接起来，组成双核铜区，具有抗磁性，因而在EPR上无信号产生。Silvia Garavaglia等1

33、0认为在Rigidoporus lignosus(RiL)中，T3Cu(a)、T2Cu分别与1个OH相连是导致EPR沉默的原因，具有EPR活性的是与来自3个His的N原子相连的T3Cu(b)，而不是T2Cu。T2和T3中心紧密相连形成一个三核中心，其结合方式可能有以下三种模式：(1)三个同原子族是通过羟基和/或过氧基桥链连接，早期的报道均持这种观点；(2)通过双氧（过氧）连接，两个氧原子到三个铜原子的距离几乎一样，均在2.42.6之间，同两个T3Cu呈（扭曲）四面体，同T2Cu呈平面四方构型，Hakulinen等的分离态22和重组态23以及Bento等24的CuCl2浸泡态结构支持这种模型，(

34、3)三个铜都同一个3-氧连接，另一个氧原子已经转变成水离去25，这可能是反应过程中的一种状态。1.3c 活性中心结合方式T1Cu距离三核中心约为1.25nm，通过T1Cu-Cys-His-三核中心联系起来，形成电子传递通道。Leif J26等人研究T. versicolor活性中心时发现其含有2个二硫桥：Cys117与Cys205形成一个二硫桥，把T1Cu区和T2Cu区联系起来；Cys85与Cys487形成另一个二硫桥，把T1Cu区与T3Cu区联系起来。从空间结构上看，T1Cu可能距离两个T3Cu约1327，而T2Cu到两个T3Cu的距离可能略微不等，T3Cu原子对间的距离约为4.8。总结所有

35、有关漆酶结构的报道，三核中心无一例外的位于酶蛋白中央空穴，形成相对保守的结构。2. 漆酶的功能2.1 漆酶活性的影响因素漆酶活性会受到一些酸的影响，如盐酸、磷酸、甲酸等，而碳酸，磷酸等的钠盐则对漆酶活性几无影响28,29，Bertrand于1908年对此作了最早报道。真菌漆酶和漆树漆酶都能被叠氮及氰化物、EDTA和二乙基二硫代氨基甲酸酯等抑止，但不受CO影响。一般来说，铜螯合剂对漆酶的活性都有抑制作用，（但乙二胺四乙酸能增加P. conchatus漆酶的反应活性），不同的抑制剂对漆酶活性的抑制作用不一样，抑制剂对漆酶活性的影响随抑制剂浓度的不同而不同，抑制剂浓度越大，其抑制作用越强。在一定的温

36、度范围内，随着反应温度的升高，漆酶的酶活力增加。但是，温度越高，漆酶越不稳定，也就越易失活。pH值对漆酶酶活性亦有类似影响，一般来说，大多数漆酶在碱性环境中不稳定、易失活。另外，介质、电磁场和糖链等等也对漆酶活性有影响。就其实质，可能是由于这些因素都会改变漆酶蛋白的空间结构，影响漆酶分子在溶液中的伸展特性所致。但是具体如何影响、作用的机制等都还因为体系的复杂性而不很清楚，所进行的探讨基本上还都只是宏观的，外在的。随着结构的越来越清晰，估计以后的研究会集中到结构活性（构效）关系上来。2.2 漆酶的催化氧化漆酶的催化氧化过程相当复杂，相比较其他多酚氧化酶，漆酶反应过程中不产生有害的过氧化氢和活性氧

37、(ROS)，但同时产生醌或半醌等强抗氧化剂及水，是非常绿色的反应。漆酶具有广泛的作用底物，基本上只要底物是具有相似于儿茶酚型的邻、对二酚就能够被漆酶催化，但酪氨酸一般不能被真菌漆酶催化氧化30,31。2.3 漆酶的催化机理漆酶催化机理较为复杂，反应不同机理也不同，漆酶的催化氧化过程主要包括：酶分子对底物的结合、电子在酶分子中的转移、氧分子的还原和产物的反作用。漆酶是单电子氧化还原酶，它催化氧化还原反应机理主要表现在两方面。一方面是底物自由基中间体的生成。漆酶从底物分子中提取一个电子，使之形成不稳定的自由基，其可进一步发生聚合或解聚反应。还原态漆酶可被O2氧化，O2被还原为水。另一方面，整个催化

38、反应是通过四个铜离子协同传递电子和价态变化来实现的。底物结合于T1Cu位点，T1Cu氧化底物得到1个电子，该电子通过CuCysHis途径传递到T2T3Cu三核中心位点，结合在该位点的第二底物分子氧，接受电子被还原为水。氧的还原可能分两步进行，首先接受两个电子生成过氧化氢中间体，该中间体再得到另两个电子被还原成水14。关于分子间电子转移途径，即T1CysHisT2/T3三核中心途径，目前已知的主要有两种方式：(1) T1Cu和T2Cu从底物各得一个电子被还原，随后T1Cu和T2Cu同时向T3Cu对给出一个电子。然后T1Cu和T2Cu再次被还原，此时漆酶完全被还原，氧分子从T3Cu对连续得到4个电

39、子被还原成水。(2) 底物结合于酶催化中心的T1Cu位点被氧化，T1Cu得到一个电子被还原，通过Cu-Cys-His-三核中心途径，将T3Cu逐个还原，最后还原T2Cu24,25,32，再把电子传递给结合到三核中心的氧分子，使之还原为水。氧需要通过一个S/O通道进入三核中心，得到4个电子，被铜离子还原成水。若有某个环节受到破坏，比如底物结合、氧通道等，均可能对整个催化反应产生影响。由于受到糖链的影响，使得漆酶结构的研究进展进行缓慢，其催化机理还有许多细节有待研究。然而完全理解漆酶这种金属糖蛋白酶的结构和催化氧化机理，以及一些细节的问题，对于整个生命过程都具有深刻意义。漆酶之所以引起国内外广泛关

40、注，正是由于其催化特性和广泛的应用所带来的。3. 漆酶的应用3.1 合成方面的应用研究表明，漆酶除了可以有效降解大分子有机物质外，其合成有机物的能力也很强，如漆酶可以合成真菌色素，并且可能参与菌索的形成。另外，漆酶可以把两种小分子化合物高效聚合成新的大分子化合物，因此可利用漆酶常在温下生产高分子聚合物（如抗生素），是一种绿色的环境友好型的新方法33。3.2 有毒化合物的生物消除环境污染问题日益严重，越来越多的污染物正侵蚀着人们赖以生存的环境，漆酶在许多有毒废物的处理中都有很好的应用价值。除了降解木素外，研究发现一些白腐菌可以降解多种芳香族类化台物和有机磷类毒剂。再后来发展的固定化酶技术，更使酶

41、活回收率提高，且热稳定性较好。真菌漆酶可降解环境中多种有毒物质，对污染的局部环境进行生物修复。3.3 造纸工业中的应用漆酶具有氧化木素的能力，被广泛应用于造纸工业，尤其是生物漂白。漆酶参与木浆和草浆的漂白都有报道。试验证明，漆酶和合适的介体协同作用，对低值的木浆有高选择性，去除木素效率达到45。 3.4 食品工业中的应用漆酶在改善人们生活有着不可忽视的贡献，在食品方面的应用越来越广泛。漆酶是饮料加工中常见的酶之一，主要用于饮料的澄清与色泽控制。另外食药用菌制种过程中加人漆酶制剂能加速木质素的分解，为菌丝提供更丰富的养料。试验发现，漆酶在午餐肉生产中的表现比过氧化物酶更有效，乳制品也同样如此。3

42、.5 其它方面的应用 漆酶在改善纤维特性，生物检测，生物燃料，生物传感器，工业染料脱色及木材工业中均有广泛的应用。4 总结尽管漆酶有着广阔的应用前景，但漆酶的某些性质，如其本身只能氧化酚型化物，高温易失活等又是目前其应用受阻的一个重要原因。对漆酶分子结构及其特性的研究就是为了有目的地改善漆酶的特性，增加其氧化性和稳定性，但目前对漆酶分子结构尤其是空间结构认识还有待进一步的研究。随着分子生物学方法的快速发展及漆酶研究的不断深入，必将有更多的漆酶蛋白的结构及作用机理被阐明。参考文献1Xu, F.et.al. A study of a series of recombinat fungal lacc

43、ases and bilirubin oxidase that exhibit significant differences in redox potential, substrate specificity, and stability. Biochim. Biophysica Acta 1292, 303-311(1996).2Xu, F. Oxidation of phenols, anilines and benzenethiols by fungal laccases: correlation between activity and redox potentials as wel

44、l as halide inhibition. Biochemistry35, 7608-7614(1996). 3张敏，肖亚中，龚为民真菌漆酶的结构与功能J生物学杂志，2003，20(5)：684刘淑珍，钱世钧担子菌漆酶的分离纯化及其性质研究J微生物学报，2003，43(1)：73785Mayer，AMand Harel，E(1979) Phytochemistry 18，1936Shin K S，Lee Y JPurification and characterization of a new member of the laccase fanfily from the white-rot

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