层析填料的选择及其装柱技术介绍幻灯片

1、层析填料的选择层析填料的选择及装柱技术介绍及装柱技术介绍佳辰公司生物中心佳辰公司生物中心 陈阶陈阶2012-04-18如何选择填料？如何选择填料？n一、依据所纯化的对象的各物理和化学特性。（一般包括蛋白、酶、重组蛋白、单抗、抗体及抗原、肽类、病毒、核酸等）n二、纯化所要达到的目的（粗提？中度纯化？精细纯化？）。n三、所要选择的层析方法n 1. 凝胶过滤 ( Gf)n 2. 离子交换 ( IEX)n 3. 亲和层析 ( AC)n 4. 疏水层析 ( HIC)n 5. 反相层析 ( RPC)n四、填料自身的物理化学特性合理衔接不同层析技术IEXHIC粗粗样或样品含高盐样或样品含高盐GF脱盐GF脱盐

2、GF脱盐ACIEXHIC或者需要稀释IEXGF或或RPCGF或或RPCGFGF样品澄清样品澄清粗提粗提中度纯化中度纯化精细纯化精细纯化凝胶过滤如何选择填料？凝胶过滤如何选择填料？一、一、4种主要常用的凝胶类型种主要常用的凝胶类型 n葡聚糖凝胶：Sephadex（SephadexG中G值越小，交联度越大，吸水性越小）适合脱盐、buffer交换n琼脂糖凝胶 Sepharose（宽广的分离范围）n聚丙烯酰胺凝胶 sephacryl（Bio-Gel p）n琼脂糖及葡聚糖组成的复合凝胶 Superdex（高分辨率、高回收率，运行时间短） 二凝胶过滤填料的选择原则二凝胶过滤填料的选择原则 1凝胶的交联度越

3、高，孔径越小。 2对大分子物质的分离，多采用琼脂糖。 3对小分子物质的分离，多采用葡聚糖。 4凝胶颗粒的粗细影响分离效果。 Sephadex LH-20为例为例nSephadex LH-20 是由葡聚糖G-25 羟丙基化加工而成，属于分子筛凝胶，尤其适用于天然产物在有机溶剂中的纯化。例如：类固醇、萜类、脂类以及小分子多肽等。nSephadex LH-20 同时具备亲水和亲脂双重性质，且被分离物质的极性在分离过程中起着重要作用。nPharmadex LH-20同时适用于分子类别非常相似的物质的分离和工业规模的制备，既可用于初步纯化步骤，也可用于最终精制步骤，如非对映同分异构体的分离。Sephad

4、ex LH-20为例为例n对于Sephadex LH-20 而言，25100m 的粒径范围相对于许多用于制备色谱的填料而言，不能说分布均一，也就是说其粒径分布较宽。然而当胶溶胀后就相对容易得到均一的柱床。这对于长柱（最高至250cm）而言也是同样的。在装柱前，层析柱和储槽都必须进行彻底的清洗。Sephadex LH-20 在使用之前必须进行溶胀。在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器。n 1 在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时，溶胀后胶体积的大小决定于所使用的溶剂系统。n 2 使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25%，这时，悬浮液从

5、一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。n 3 将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。（考虑到损耗，称量考虑到损耗，称量Sephadex LH-20干胶干胶138g（柱体积（柱体积589.05 ml），放入），放入2000 ml的烧杯中，加入双蒸水的烧杯中，加入双蒸水1200 ml并在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温并在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸至近沸10分钟，随后取出，室温静置分钟，随后取出，室温静置3小时以上，直到温度降为室温。小时以上，直到温度降为室温。）溶溶剂剂溶胀系数（溶溶胀系数（溶胀体积胀体积ml/ml/干胶干胶g

6、 g）吸收能力（吸收吸收能力（吸收溶剂体积溶剂体积ml/ml/干胶干胶g g）水水 4.04.04.44.42.12.1D DM MS SO O4.44.44.64.6-乙乙醇醇3.63.63.93.91.81.8离子交换层析如何选择填料？离子交换层析如何选择填料？n根据被分离物质分子表面电荷性质进行吸附解吸附。离子交换层析如何选择填料？离子交换层析如何选择填料？离子交换层析如何选择填料？离子交换层析如何选择填料？n利用被分离的（生命大分子）物质和特异性配利用被分离的（生命大分子）物质和特异性配体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层体之间能可逆性结合与解离的原理而建立的层析方法。析方法。n分

7、类：分类： 特异性配体亲和层析：特异性配体亲和层析：配体一般为复杂的配体一般为复杂的生命大分子物质（如抗体、受体、酶的类似物生命大分子物质（如抗体、受体、酶的类似物等）。其特点是吸附特异性强，结合力大等）。其特点是吸附特异性强，结合力大 通用性配体亲和层析：通用性配体亲和层析：配体一般为简单的配体一般为简单的小分子物质（如金属、染料、氨基酸等）。其小分子物质（如金属、染料、氨基酸等）。其成本低，具有较高的吸附容量，但分辨率不及成本低，具有较高的吸附容量，但分辨率不及前者前者亲和层析亲和层析亲和层析如何选择填料？（亲和吸附介质：基质+配体）一、基质的选择一、基质的选择理想的基质应符合下面的要求：

8、理想的基质应符合下面的要求：1 1极低的非特异性吸附。极低的非特异性吸附。2 2高度的亲水性。高度的亲水性。3 3较好的理化稳定性。较好的理化稳定性。4 4大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配体结合。5 5适当的多孔性。适当的多孔性。一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多孔玻璃珠等。常用亲和吸附剂采用的基质常用亲和吸附剂采用的基质 一般有纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、一般有纤维素、聚丙

9、烯酰胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖以及多孔玻璃珠等。交联琼脂糖以及多孔玻璃珠等。商品纤维素：商品纤维素：具有非特异吸附性，且本身结构不均一具有非特异吸附性，且本身结构不均一聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖：聚丙烯酰胺凝胶和交联葡聚糖：与配体结合后，多孔性会大与配体结合后，多孔性会大大降低，且聚丙烯酰胺凝胶具有大量酰胺键，不易在载体与大降低，且聚丙烯酰胺凝胶具有大量酰胺键，不易在载体与配体之间引入间隔物配体之间引入间隔物玻璃珠：玻璃珠：具有多孔性好，机械性能强等优点，但对有的物质具有多孔性好，机械性能强等优点，但对有的物质也有一定的吸附力也有一定的吸附力 目前使用最广泛的是目前使用最广泛的是S

10、epharose 4B，它是有，它是有D-半乳糖半乳糖和和3，6-脱水脱水-L-半乳糖结合成的链状多糖，极易用溴化氰活半乳糖结合成的链状多糖，极易用溴化氰活化，并易于引入不同基团；在温和条件下可连接较多的配体，化，并易于引入不同基团；在温和条件下可连接较多的配体，容易吸附大分子物质，且吸附容量较大容易吸附大分子物质，且吸附容量较大二、配体的选择二、配体的选择理想的配体应具有以下一些性质：理想的配体应具有以下一些性质：1) 配体与待分离的物质有配体与待分离的物质有适当的适当的亲和力。亲和力。2) 2) 配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性。配体与待分离的物质之间的亲和力要有较强的特异性

11、。3) 3) 配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不配体要能够与基质稳定的共价结合，在实验过程中不易脱落。易脱落。4) 4) 配体自身应具有较好的稳定性配体自身应具有较好的稳定性。 根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为两类：两类：特异性配体（特异性配体（specific ligandspecific ligand）和和通用性配体通用性配体（general ligandgeneral ligand）亲和层析如何选择填料？（亲和吸附介质：基质+配体）亲和吸附介质的配基n（1）酶的抑制剂）酶的抑制剂 n （2 2）抗体）抗体n（3

12、3）A A蛋白蛋白 A A蛋白（蛋白（protein Aprotein A）为分子量约）为分子量约42KD42KD的蛋白质，的蛋白质，存在于黄色葡萄球菌（存在于黄色葡萄球菌（StaphylococcusaureusStaphylococcusaureus）的细胞壁中，占）的细胞壁中，占该细胞壁构成成分约该细胞壁构成成分约5 5。A A蛋白在确定其为蛋白质之前称蛋白在确定其为蛋白质之前称A A抗原。抗原。n（4 4）凝集素）凝集素凝集素凝集素(lectin) (lectin) 是与糖特异性结合的蛋白质（酶是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的和抗体除

13、外）的总称，大部分凝集素为多聚体，含有两个以上的糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。糖结合部位，不同的凝集素与糖结合的特异性不同。n（5 5）辅酶和磷酸酰苷）辅酶和磷酸酰苷n（6 6）过渡金属离子）过渡金属离子n（7）组氨酸）组氨酸n（8 8）肝素）肝素（heparinheparin）能用于亲和层析的分子上的基团能用于亲和层析的分子上的基团亲和介质反应基团亲和介质反应基团偶联方偶联方法法物理方法物理方法 包埋法包埋法和和吸附法吸附法等等化学方化学方法法偶联法偶联法：利用：利用CNBr、环氧氯丙烷、双环、环氧氯丙烷、双环氧乙烯、丁二烯砜、亚胺二烯酸等化学试氧乙烯、丁二烯砜、亚胺二烯酸等

14、化学试剂使配体与活化的基质偶联或形成螯合物剂使配体与活化的基质偶联或形成螯合物交联法交联法：即用戊二醛、碳二亚胺等双功能试：即用戊二醛、碳二亚胺等双功能试剂交联基质与配体剂交联基质与配体 CNBr是最常用的偶联剂，偶联过程分为基质的活化、偶是最常用的偶联剂，偶联过程分为基质的活化、偶联、去除未结合配体、配体结合量的测定等步骤联、去除未结合配体、配体结合量的测定等步骤基体配体吸附剂的制备基体配体吸附剂的制备以以CNBr活化的琼脂糖凝胶活化的琼脂糖凝胶4B为例为例nCNBr活化活化Sepharose 4B产生的氰酸酯可和蛋白质类配体一氨基共产生的氰酸酯可和蛋白质类配体一氨基共价偶联作用。价偶联作用

15、。n5.0g溴化氰活化的琼脂糖凝胶溴化氰活化的琼脂糖凝胶4B粉末溶于粉末溶于100毫升的毫升的1mMHCl-静置静置15-20分钟，使之膨胀分钟，使之膨胀-以水流抽气方式经以水流抽气方式经Whatman NO.5滤纸去除滤纸去除HCl-再以再以1mMHCl清洗清洗-以总量为以总量为100ml的的偶联缓冲液（偶联缓冲液（0.1M碳酸氢钠碳酸氢钠+0.5M氯化钠，氯化钠， PH8.3）分数次清洗）分数次清洗-将吸干的溴化氰活化的琼脂糖凝胶自滤纸上刮下，加入含将吸干的溴化氰活化的琼脂糖凝胶自滤纸上刮下，加入含CA-OVA120毫克的偶联缓冲液毫克的偶联缓冲液20毫升毫升-以试管反复颠倒的混匀以试管反

16、复颠倒的混匀方式于室温下反应方式于室温下反应2小时。小时。-以以900rpm离心离心5分钟，以去除偶分钟，以去除偶联缓冲液（收集，测未偶联的联缓冲液（收集，测未偶联的CA-OVA的量）的量）-加入加入20毫升毫升封闭缓冲液（封闭缓冲液（0.2M甘氨酸，甘氨酸，PH8.0）-以试管反复颠倒的混以试管反复颠倒的混匀方式于室温下反应匀方式于室温下反应2小时小时-再以偶联缓冲液清洗一次再以偶联缓冲液清洗一次-以以100毫升含毫升含0.5N NaCl的的0.1M醋酸缓冲液清洗醋酸缓冲液清洗-最后以偶联缓冲最后以偶联缓冲液清洗五次，即可装填管柱。液清洗五次，即可装填管柱。疏水层析如何选择填料？疏水层析如何

17、选择填料？n疏水层析和反相层析(reversed phase chromatography)分离生命物质的依据是一致的，即:视有效成分和固定相之间相互作用的差异性大小，将有效成分分离出来疏水层析填料类型疏水层析填料类型1亲水性填料 n基质主要是：交联琼脂糖(Sepharose CL-4B) n配体是：苯基或辛基化合物 基质与配体通过耦合方法构成稳定的苯基(或辛基)-Sepharose Cl-4B吸附剂2非亲水性填料 n基质有：硅胶、树脂(苯乙烯、二乙烯聚合物)等。 n配体为：苯基、辛基、烷基(C4、C8、C18)等，二者通过共价结合构成非亲水性吸附剂。疏水层析填料选择考虑因素疏水层析填料选择考

18、虑因素n目标蛋白的疏水性 （包括纯化策略即：是否是高度纯化）n填料基质及配基物理化学特性n填料中配基的取代度n填料的吸附解吸附条件与目标蛋白的兼容性。凝凝胶胶基基架架粗粗分分离离中中度度纯纯化化 精精细细纯纯化化P Ph he en ny yl l S Se ep ph ha ar ro os se e 6 6 F FF F ( (H Hi i g gh hS Su ub b) )P Ph he en ny yl l S Se ep ph ha ar ro os se e 6 6 F FF F ( (L Lo ow wS Su ub b) )O O c ct ty yl l S Se ep p

19、h ha ar ro os se e 4 4 F FF FB Bu ut ty yl l S Se ep ph ha ar ro os se e 4 4 F FF FP Ph he en ny yl l S Se ep ph ha ar ro os se e H HP PS SO O U UR RC CE E 1 15 5 P PH HE E, , I I S SO O , , E ET TH H疏水介质选择疏水介质选择反相层析如何选择填料反相层析如何选择填料n所谓“正相”或“反相”，主要是指固定相和流动相的相对极性大小，反相层析因与传统分因与传统分配层析配层析刚好相反刚好相反而得名而得名，其

20、，其固定相非极性强而流动相极性相对较高，样品中组分被洗脱的顺序是极性较高的组分先流出，极性较低的后被洗脱。n反相介质的选择性主要由键合在基质上的配基类型决定。最常用的配基是线性的正烷烃基团（n-烷基），如n-辛基（C-8）、n-十八烷基（C-18），此外也会采用n-丙基、n-丁基、n-丙基苯基、二苯基等疏水基团。 反相层析介质n 由多孔基质颗粒键合疏水性的配基组成，因具较小的颗粒直径，普遍有较高的柱效； n反相层析领域使用时间最长，应用最广泛的基质是硅胶 缺点：高pH下非常不稳定 新开发以合成有机物作为基质的反相介质-如聚苯乙烯-二乙烯苯类 ，具优良的化学稳定性，强酸强碱下的稳定性弥补了硅胶基

21、质的缺陷 。 反相层析填料常见类型（一）SOURCETM RPC （聚苯乙烯颗粒） 能耐受反相层析中常用的有机溶剂，对6mol/L的盐酸胍、0.1%的SDS等具良好耐受能力 各种肽、蛋白质、寡聚核苷酸等分析和制备型分离纯化（二）RPC C2/C18 （多孔硅胶微粒为基质 ） 在有机溶剂中稳定性较好，但pH稳定范围较窄，仅能在pH27范围内使用，对变性剂、去污剂等试剂具良好的耐受，操作温度范围440 粒径小，适合肽谱分析和极微量纯化过程（三）Sephasil Protein / Sephasil Peptide （多孔硅胶为基质） 理化稳定性和RPC C2/C18介质相似，温度范围470反相层析

22、填料的选择原则n考虑样品组分的种类和性质、分离的规模及对分辨率的要求、流动相条件：n待分离物分子量，对介质孔径的选择提供指导； n样品组分的疏水性质决定采用何种配基；n分离的规模及对分辨率的要求也是须考虑的因素，通常分离规模和分辨率的关系是负相关的 ；n 反相层析时的流动相条件很大程度上影响反相介质基质的选择。C4C8C18Silica-basedSOURCE RPCPolystyrene/DVBSOURCE RPC家族:聚合体基架vs传统硅胶基架硅胶基架硅胶基架 工作pH局限于7 颗粒大小不均一 专用于高效液相 装柱比较困难 清洗比较困难聚合体基架聚合体基架 PH范围 pH 1-14 均一的

23、颗粒 压力低 容易装柱与放大 用 NaOH方便清洗 较大的孔径 300 质量传递有改善 用于纯化蛋白，大肽及其DNA硅胶- 硅烷醇bead 较窄的孔径 50-100 质量传递受限制 用于纯化肽类bead 硅烷醇 醚,硅烷醇的原料3-15 mSiOHSSiiOSOURCE RPC家族:聚合体基架vs传统硅胶基架硅胶- 硅烷醇- 配基 O Si CH2 C H2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH3CHCH3C2 O Si CH2 CH3CH3CH3C8 O Si CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 CH

24、2 CH2 CH3CH33CHC18硅烷醇基团18烷基团 C2SiOHSiOSi(CH2)17CH3CH3CH3CH3SiOSiCH2CH3CH3SSiiOBeadSOURCE RPC家族:聚合体基架vs传统硅胶基架我们用的我们用的POROS R1 50n基质：Cross-linked poly(styrene-divinylbenzene)n表面基团：native poly (styrene-divinylbenzene)n溶胀系数：1% from 1-100% solventn颗粒大小：50umn最大流速（最大压力）：2000cm/hr(10MPa)npH范围：114n温度范围：580n化

25、学耐受性：水，0100%酒精、乙腈等常见溶剂均有很好的耐受性nPoros 50填料基本不会萎缩也不会膨胀，所以装柱时不需要在液面上留下缓冲空间凝胶的保存凝胶的保存 凝胶的保存： 1经常使用的凝胶以湿态保存为宜。 2长期不用的凝胶可采用干燥保存法。 实验室层析柱装柱技术实验室层析柱装柱技术介绍介绍n好的柱效是层析成功的关键n不同种类的凝胶、不同的层析柱有不同的装柱方法n柱效测定的方法n层析柱的维护 柱长柱长 1L/D（长度/直径）：比值高的柱子分辨率高； 2柱长相同时：直径大 分辨率高； 直径小 分辨率低。 3分析时，采用直径较小的柱子； 制备时，采用直径较大的柱子。 4交联度小的凝胶柱不宜细而

26、长，否则操作上有困难。 理论塔板数理论塔板数N/m= 5.54 (Ve/Vh)2100/L As = b/a 检测柱效检测柱效n检测装柱效果一般用0.5% (30um介质)或1% (90um介质) 柱体积的1%丙酮测柱效和峰形nThe linear flow rate should be 30 cm/h for 34 m and 50 m media and 20 cm/h for 90 m media填料装柱前处理填料装柱前处理 1除去影响流速的过细颗粒 “水力浮洗法”：将颗粒粗细不均的凝胶悬浮在大体积的水中，让它自然沉降，过细的颗粒浮在上面，倒去即可。反复几次。 2溶胀 使用前需直接在欲使

27、用的洗脱液中浸泡溶胀。通常使用“热法”溶胀，即在沸水浴中，将悬浮于洗脱液中的凝胶浆逐渐升温到近沸，12小时即可。 计算柱子的上样体积计算柱子的上样体积1.分析工作时，样品体积为柱床体积的14%； 制备分离时，样品体积为柱床体积的2530%。2. 分离体积（Vsep=Ve1-Ve2） 当样品体积Vsep时，两个相邻组分不能完全分离。 装柱一般步骤装柱一般步骤 1装柱：先在柱中加入约1/3高度的洗脱液，边搅拌边加入凝胶悬浮液。 2平衡 3检查柱子是否均匀 流速的换算流速的换算n线性流速n对体积不同的柱子来说，体积流速不能直接用作比较， 一般都换算成线性流速，再作比较：n 体积流速 (ml/min)

28、 x 60n 线性流速 (cm/hr) = n 柱子横切面积 (cm2) 操作压力操作压力1洗脱时维持流速的恒定。2用恒流泵维持恒压，从而维持恒流。3. 装柱时，为了压实柱床，应该逐步阶梯型提升压力（注意不能超出填料或柱子的最大压力） 装柱需要注意的几点装柱需要注意的几点n选择一根设计良好的柱子n仔细混合均匀凝胶浆n在生产时使用柱子的温度下装柱n用平缓的动作将凝胶浆一次性加入柱子中n用恒压或恒流装柱n稳定和平衡凝胶柱床n检查柱效，必要时重装装柱后nIt is important that the column is properly equilibrated before the packing is evaluated ( 2 column volumes). It is preferable to run three test runs to see whether the test values are stable. nIf a poor result improves during this test, the reason can be that the column was not properly equilibrated.nTo check that