消化毒剂的作用机理课件

1、消化毒剂的作用机理1第七节第七节 消化毒剂的作用机理消化毒剂的作用机理 1996年，吴文君等首次提出了消化毒剂的概念，把主要作年，吴文君等首次提出了消化毒剂的概念，把主要作用于昆虫消化系统，即主要以消化系统为初始靶标的杀虫剂为用于昆虫消化系统，即主要以消化系统为初始靶标的杀虫剂为消化毒剂。消化毒剂。 破坏中肠破坏中肠 中肠组织破坏剂中肠组织破坏剂 影响消化酶系影响消化酶系 消化抑制剂。消化抑制剂。 主要种类：主要种类： Bt内毒素内毒素 植物源次生代谢物植物源次生代谢物如二氢沉香呋喃类化合物等。如二氢沉香呋喃类化合物等。 两类靶标两类靶标消化毒剂的作用机理2一、一、 Bt内毒素内毒素 苏云金杆

2、菌（苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt），产品已达），产品已达60余种，余种，是世界上产量最大、应用最广泛的微生物杀虫剂。是世界上产量最大、应用最广泛的微生物杀虫剂。 基本作用机理基本作用机理 BtBt的杀虫活性主要是其产生的杀虫蛋白晶体在起作用。杀虫的杀虫活性主要是其产生的杀虫蛋白晶体在起作用。杀虫蛋白晶体，也叫原毒素（蛋白晶体，也叫原毒素（protoxinprotoxin），是由多个杀虫晶体蛋白），是由多个杀虫晶体蛋白（insecticidal crystal proteins,ICPs）或）或-内毒素（内毒素（-endotoxin）或或CryCry（晶体）蛋白

3、的亚单位组成。昆虫摄食该毒蛋白后，在中肠（晶体）蛋白的亚单位组成。昆虫摄食该毒蛋白后，在中肠的高的高pHpH环境和蛋白酶的作用下，毒蛋白晶体溶解并被激活，引起环境和蛋白酶的作用下，毒蛋白晶体溶解并被激活，引起试虫中肠膜上皮细胞裂解。试虫中肠膜上皮细胞裂解。 症状：试虫失去运动能力，不停颤抖，呕吐，停止取食，死亡。症状：试虫失去运动能力，不停颤抖，呕吐，停止取食，死亡。 消化毒剂的作用机理3消化毒剂的作用机理41. Bt杀虫晶体蛋白（杀虫晶体蛋白（Isecticidal Crystal Proteins，ICPs） 杀虫晶体蛋白是由苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白是由苏云金芽胞杆菌( ( Bacill

4、us Bacillus thuringiensis thuringiensis ，Bt)Bt)所产生的毒素。所产生的毒素。 毒蛋白主要有毒蛋白主要有7 7种：种：-外毒素、外毒素、-外毒素、外毒素、-外毒外毒素、素、- -内毒素、不稳定外毒素、水溶性毒素、鼠因子内毒素、不稳定外毒素、水溶性毒素、鼠因子外毒素。外毒素。- -内毒素是在形成芽孢的同时形成的蛋白质晶内毒素是在形成芽孢的同时形成的蛋白质晶体，位于芽孢之旁，所以又称伴孢晶体毒素，是主要体，位于芽孢之旁，所以又称伴孢晶体毒素，是主要的杀虫晶体蛋白，这种晶体蛋白只是一种前毒素的杀虫晶体蛋白，这种晶体蛋白只是一种前毒素( (Pretoxin)

5、 )，经过激活，即消化成分子量为，经过激活，即消化成分子量为100010007000070000的片段，才起毒素作用。的片段，才起毒素作用。消化毒剂的作用机理5消化毒剂的作用机理6 晶体蛋白有晶体蛋白有130130多种，按照多种，按照杀虫范围和寄主同源型杀虫范围和寄主同源型又可分为两大类群，即又可分为两大类群，即CryCry （广谱性）蛋白和（广谱性）蛋白和CytCyt（双（双翅目、活体活性低）翅目、活体活性低）蛋白，同时还发现一种营养期杀蛋白，同时还发现一种营养期杀虫蛋白（虫蛋白（VIPsVIPs），活性与专一性同），活性与专一性同CryCry。CryCry分为四大类（根据杀虫谱）：分为四大

6、类（根据杀虫谱）：CryI（鳞翅目）；（鳞翅目）；CryII( (鳞翅目和双翅目鳞翅目和双翅目) )CryIII（鞘翅目）；（鞘翅目）；CryIV( (双翅目双翅目) )。 通常一种毒素只能杀死某一目的部分易感昆虫，通常一种毒素只能杀死某一目的部分易感昆虫，对有益生物和脊椎动物安全。对有益生物和脊椎动物安全。1. Bt杀虫晶体蛋白（杀虫晶体蛋白（ICPs）消化毒剂的作用机理7 完整的毒蛋白一般由三个结构域组成。完整的毒蛋白一般由三个结构域组成。 结构域结构域由一个由一个- -螺旋束组成，可能与细胞膜穿螺旋束组成，可能与细胞膜穿 孔有关；孔有关； 结构域结构域由三组由三组- -折叠片层组成，可能

7、参与了毒折叠片层组成，可能参与了毒 素与膜受体蛋白的识别和结合；素与膜受体蛋白的识别和结合； 结构域结构域位于毒素分子位于毒素分子C-C-端，可能阻止昆虫肠道蛋端，可能阻止昆虫肠道蛋 白酶对毒性肽分子的进一步降解。白酶对毒性肽分子的进一步降解。 1. Bt杀虫晶体蛋白（杀虫晶体蛋白（Isecticidal Crystal Proteins，ICPs）消化毒剂的作用机理8消化毒剂的作用机理92. Bt毒素受体蛋白毒素受体蛋白 晶体蛋白的毒性与受体蛋白和晶体蛋白结合的能力晶体蛋白的毒性与受体蛋白和晶体蛋白结合的能力呈正相关，膜受体蛋白是毒蛋白专一性的决定因子。呈正相关，膜受体蛋白是毒蛋白专一性的决

8、定因子。 鳞翅目昆虫中肠鳞翅目昆虫中肠BtBt毒素受体蛋白主要为中肠的毒素受体蛋白主要为中肠的刷状刷状缘膜囊泡缘膜囊泡( (BBMV) )的氨肽酶的氨肽酶 N (N (aminopeptidase N，APN) )、类钙粘蛋白类钙粘蛋白CLP(CLP(cadherin-like) )以及碱性磷酸酶。以及碱性磷酸酶。 此外此外鞘糖脂鞘糖脂也是一种迄今未知的无脊椎动物也是一种迄今未知的无脊椎动物BtBt毒素毒素的普遍受体。的普遍受体。 消化毒剂的作用机理10 - -内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受内毒素的作用过程要经溶解、酶解活化、与受体结合、插入、孔洞或离子通道形成等五个环节。体结合、插

9、入、孔洞或离子通道形成等五个环节。昆虫取食孢子和毒素昆虫取食孢子和毒素毒素被蛋白酶活化毒素被蛋白酶活化毒素与膜受体结合毒素与膜受体结合毒素造成膜穿孔使细胞裂解毒素造成膜穿孔使细胞裂解3. 3. 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理消化毒剂的作用机理11 毒素的溶解毒素的溶解 晶体蛋白可以溶解于晶体蛋白可以溶解于pH 12pH 12或或pH 9.5pH 9.5并加有巯并加有巯基试剂的碱性溶液中。中肠内环境诸如基试剂的碱性溶液中。中肠内环境诸如pHpH值、还原值、还原电势、去垢性、体积等都可能影响电势、去垢性、体积等都可能影响- -内毒素在昆虫内毒素在昆虫体内的溶解性。鳞翅目幼虫的中肠体内

10、的溶解性。鳞翅目幼虫的中肠pHpH值一般都较高，值一般都较高，呈碱性呈碱性, , 对对- -内毒素的溶解很有利。内毒素的溶解很有利。3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 消化毒剂的作用机理12 毒素的活化毒素的活化 溶解的晶体蛋白被中肠蛋白酶水解，由溶解的晶体蛋白被中肠蛋白酶水解，由130kD130kD左右的前毒素，打开二硫键，释放出左右的前毒素，打开二硫键，释放出N N端的端的70kD70kD左右左右的抗酶多肽活力片段。的抗酶多肽活力片段。 活力片段至少由两部分组成活力片段至少由两部分组成, , 即毒力片段和细胞结合即毒力片段和细胞结合片段。毒力片段主要结构是片段。毒力片段主

11、要结构是- -螺旋，对于跨膜通道的形成螺旋，对于跨膜通道的形成及毒效可能起着重要作用。及毒效可能起着重要作用。 细胞结合片段由细胞结合片段由C C端的保守区和中间的可变区组成，主端的保守区和中间的可变区组成，主要结构是要结构是- -片层，负责毒素与靶标昆虫受体的结合，从片层，负责毒素与靶标昆虫受体的结合，从而决定了毒素的选择性。而决定了毒素的选择性。 中肠酶液的组成直接影响到中肠酶液的组成直接影响到- -内毒素的降解活化内毒素的降解活化, , 对对- -内毒素作用的专一性起着重要作用。内毒素作用的专一性起着重要作用。 3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 消化毒剂的作用机理13

12、毒蛋白的活化过程毒蛋白的活化过程被昆虫取食的晶体蛋白被昆虫取食的晶体蛋白在中肠被溶解在中肠被溶解碱性环境碱性环境成熟毒素成熟毒素被中肠蛋白酶消化活化被中肠蛋白酶消化活化毒素的活化毒素的活化 3 3 杀虫晶体蛋白的作用机理杀虫晶体蛋白的作用机理 消化毒剂的作用机理143 3 杀虫晶体蛋白的作用新模型杀虫晶体蛋白的作用新模型 毒素与受体蛋白的结合毒素与受体蛋白的结合 毒素被活化以后首先是通毒素被活化以后首先是通过结构域过结构域与上皮细胞膜上的受体蛋白发生专一性结与上皮细胞膜上的受体蛋白发生专一性结合。结合分为两步，第一步与合。结合分为两步，第一步与CLPCLP受体的初始结合受体的初始结合( (In

13、itial Binding) )，同时被，同时被BBMVBBMV上的蛋白酶进一步水解上的蛋白酶进一步水解去除大约去除大约3Kd3Kd的的a a1 1螺旋，聚集成四聚体结构；低聚体与螺旋，聚集成四聚体结构；低聚体与APNAPN结合即二次受体结合结合即二次受体结合, ,在在APN APN 受体的帮助下受体的帮助下, ,毒素低毒素低聚体在细胞膜脂质筏区域上聚集聚体在细胞膜脂质筏区域上聚集, ,此时的毒素与受体难此时的毒素与受体难以发生解离以发生解离, ,故为不可逆性结合故为不可逆性结合( Irreversible ( Irreversible Binding)Binding)。 消化毒剂的作用机理1

14、5 插入及孔洞或离子通道的形成插入及孔洞或离子通道的形成 与受体结合的低聚与受体结合的低聚体体, 由由APNAPN促使其运动到脂筏促使其运动到脂筏, , Cry结构域结构域在脂筏区在脂筏区插入膜内插入膜内, , 进而诱导孔的形成进而诱导孔的形成，导致膜完整性的破，导致膜完整性的破，引起离子渗漏，水随之进入细胞，细胞因膨胀而解体、引起离子渗漏，水随之进入细胞，细胞因膨胀而解体、死亡。四聚体与毒素单体不同，能够在膜上形成稳定死亡。四聚体与毒素单体不同，能够在膜上形成稳定的孔道。这一理论解释了的孔道。这一理论解释了APNAPN作为重要的功能性受体却作为重要的功能性受体却与单一与单一Cry1ACry1

15、A毒素亲和力低的原因。毒素亲和力低的原因。 3 3 杀虫晶体蛋白的作用新模型杀虫晶体蛋白的作用新模型 消化毒剂的作用机理16消化毒剂的作用机理17结构域结构域由由6-76-7个两亲的个两亲的-螺旋围绕着一个疏水的中心螺旋螺旋围绕着一个疏水的中心螺旋形成。其穿孔机制被认为是结构域形成。其穿孔机制被认为是结构域IIII在完成毒素在完成毒素- -受体识别后，受体识别后，与受体结合的结构域与受体结合的结构域的的6 6个个-螺旋像一把撑开的伞将中心的螺旋像一把撑开的伞将中心的螺旋插向膜结构螺旋插向膜结构, ,同时把结构域同时把结构域也推向膜脂也推向膜脂, , 进而形成通道进而形成通道, , 导致上皮细胞

16、的导致上皮细胞的K+K+渗透势和渗透势和pHpH梯度被破坏。组织病理学试验显梯度被破坏。组织病理学试验显示中肠柱细胞成空泡状示中肠柱细胞成空泡状, , 微绒毛损伤微绒毛损伤, ,中肠内充满上皮细胞内中肠内充满上皮细胞内容物容物, , 中肠细胞消亡中肠细胞消亡, , 最后昆虫幼虫死亡最后昆虫幼虫死亡。结构域结构域在杀虫蛋白中的作用在杀虫蛋白中的作用3 3 杀虫晶体蛋白的作用新模型杀虫晶体蛋白的作用新模型 消化毒剂的作用机理18-4螺旋螺旋-5螺旋螺旋细胞膜细胞膜-5螺旋螺旋-4螺旋螺旋细胞膜细胞膜图图2 Bt杀虫毒蛋白作用的伞型模型与形成孔道原理示意图杀虫毒蛋白作用的伞型模型与形成孔道原理示意图

17、消化毒剂的作用机理19 这个新的模型首次提出了这个新的模型首次提出了 CryCry毒素在昆虫的毒素在昆虫的BBMVBBMV上不是只同一个受体相互作用上不是只同一个受体相互作用, ,而是与两个的受体先而是与两个的受体先后发生结合后发生结合, ,强调了脂筏在形成孔的过程中的作用强调了脂筏在形成孔的过程中的作用, ,而而且解释了且解释了APNAPN作为重要的功能性受体却与单一作为重要的功能性受体却与单一Cry1ACry1A毒毒素亲和力低的原因。素亲和力低的原因。这种与几个受体分子先后结合这种与几个受体分子先后结合, ,并通过脂筏插入膜或进入细胞的机制在其它的毒素并通过脂筏插入膜或进入细胞的机制在其它

18、的毒素( (如气单胞菌溶素如气单胞菌溶素) )和病毒和病毒( (如艾滋病病毒如艾滋病病毒) )的致病过程的致病过程中是普遍存在的。该模型的提出使我们能更完整地解中是普遍存在的。该模型的提出使我们能更完整地解释释Bt Bt 的毒性和抗性机制的毒性和抗性机制, ,对其它病原的致病机理研究对其它病原的致病机理研究也有借鉴作用。也有借鉴作用。3 3 杀虫晶体蛋白的作用新模型的意义杀虫晶体蛋白的作用新模型的意义 消化毒剂的作用机理20二氢沉香呋喃类化合物：二氢沉香呋喃类化合物：苦皮藤素苦皮藤素、等可致等可致粘虫：中肠柱状细胞的微绒毛排列不整齐，大量脱落；粘虫：中肠柱状细胞的微绒毛排列不整齐，大量脱落；基

19、膜内褶空间变大，排列紊乱；细胞质密度降低；内基膜内褶空间变大，排列紊乱；细胞质密度降低；内质网极度扩张质网极度扩张 ，囊泡化，核糖体脱落；线粒体嵴模糊，囊泡化，核糖体脱落；线粒体嵴模糊不清楚，双层膜不完整。推测其机理为：此类化合物不清楚，双层膜不完整。推测其机理为：此类化合物与昆虫中肠细胞膜及内膜结合，膜系统结构发生改变，与昆虫中肠细胞膜及内膜结合，膜系统结构发生改变，水分和各种离子的通透性随之改变，引起细胞肿胀、水分和各种离子的通透性随之改变，引起细胞肿胀、失水、瓦解，最终死亡。推测其机理为：失水、瓦解，最终死亡。推测其机理为：此类化合物此类化合物与昆虫中肠细胞膜及内膜结合，膜系统结构发生改变，与昆虫中肠细胞膜及内膜结合，膜系统结构发生改变，水分和各种离