荧光PCR定量质量控制及防污染措施

1、荧光PCR定量质量控制及防污染措施解放军第三0二医院王海滨写在课前得话近几年在临床捡测病#核酸与细苗核酸上，荧光定童PCR技术越来越广泛。但就是如何进行治疗控制以及出现污 染后怎样进行溝除污染？本文主要讲述怎样来防止污染埒产生。-、荧光PCR龙量得概述（一）荧光PCR丈量得原理实时荧光定董PCR技术，就是北在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧龙伎号积累实时监浏整个PCR进程. 最后通过标淮曲线对未知換板进行定董分析埒方法。常规埒PCR也就就足电泳PCR.它就是合成一个正向引物与反向引 物为目埒歿机即DNA戎RNA作为一个棧板扩增，扩增后通过跑电泳得方式来栓测它存在与否，就足和对童硯変化。由于

2、 跑电泳经常字致产场外泄.园此汚熹埒几牢比校高。近几年PCR扩增时在填入一对引物得同时參入单个特异性埒荧光探针该探针为一寡核菩酸两端分别标记单个 报告荧光基团与单个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基印发射捋荧光信号祓淬灭基印吸收:PCR扩增时，Taq他僻5， 端3端外切醴活性将探针酶切绛解使报告荧丸基Ifl与淬灭荧光基团分离，从而荧光监浏系统可按收到荧光信号，即每 扩增一条DNA讎就有单个荧光分子构成，实现了荧光信号珞累积与PCR产物构成完全同步。通过荧光场用参入与TapMan探针技禾来做实时荧光PCR 迟免了电泳检测结果得过程使整个PCR过程从扩增到栓 浏都在一个封闭捋状态。荧光集团目前临床常

3、用埒有两个，一个就足SYBR green.-个就足TapMan探针。SYBR green就 足一类荧光粢针，能与所有埒DNA改锥相结合对DNA楔板没有选择性，所以牯异性不如TapMan探针。变性E双嫁 祓変成单檢桟后作为扩增埒模板。在扩增捋过程中由変性到负性扩出了另一条讎与楔板DNA进行退火变成班链。这时 SYBR green 料与DNA班讎结合发出荧光信号JI SYBR green荧光染料来作为脂示剂时中间要加一个溶解曲线来证 实它埒特异性捋问題。另一个就足TapMan探针，在两个引物中何没班一条卅异性埒探针，它标记有荧光染料通过澈发与检浏得过程来检 浏骑异性扩增根板埒存在。（二）PCR原理

4、图典型鸽PCR三电循环30JO个第一步：95X横仿机体核酸合成的条件和过 程.在通过休外实脸技术实现已 知核酸的放大却绘测。第二步:退火50-60X第三步票延伸72X核胆册列引初DMA.多緊晦（三）定量原理(R) $TaqMan丸亠-r涪洱泳3河亠丹殴PCR法汽淤球洙祚辿3Taq詹丰3PJ5P 净C*亦申&+丸卒S孩茁誌和琴*床諾冷苫亦申丰粢&営左浄7荒芜丰4SO 4 末？汗丰丹*PCR 対尿淙浹七巴畝|泮 4 一養S 渝京芋。菽亠-rFJJrs亠*玮咨諾少沽呆令P片*目洋4 一茁N色，京聲丰g篆 亦&封盜站忸s(Reporter、) 古 FAM , vo4:3P (QuencherQ) tT

5、AMRA W5S w丰异沆益命滋s蛋憑淫丰净c*誅*曲莘冷泳曰思淙玄w挣送啊竺亦申。 农金了Taq屈4滚笊令一一说七 &悭5盜朱諾丰末芋祜30丄5匸甲兰或於祐沫営眇节丸芋吉操注弁枷曰琢調莘冶枷曰.存冷*识誅殊主淙二P 卞联冷PCR窑去净苫亦申&事九朿kql+*MI-sp誌律就沐丰1盘。胡申丰论涔左 7孩茁DNA事兴Jur涂碎益苏(l)4fc*li丹*滋J!?曽亦孩茁*丰諾架S C(T)S5R冻Na;主荡沫比渦。岂亦DNA痒&W冷C*用竺袖1廉(茨恳)异虫 詢廉车忘为韩&9法总Ct恳冷泳&海&苓洋苦用 洋&彗丰46纸；1.爲涔4奈为聲网澤|1水汹(含19)二2生* 邸片2i侪2済耕丰忘为韩誌科孚

6、匸味主水七深觀丰孩芜除首先一个好埒试剂要有特异性。现在临床栓脸用埒试剂祁就足要求国家药淮局所批埒试剂因此它序列埒牯异性 祁就是通过专寧所认证埒。但就是Pl SYBR green染料遥行定董时妥注意在放射学应用之前或在确定放射学就足不就足 可円时奂通过溶解曲线来对这个方法做一个牯异性硯评价。另外要注意交叉性得问题矜别就是做细苗16sRNA埒检测， 试剂制备就是在国察严格要求得GMP厂房里生产。试剂出厂后运檢到捡浏单位,地们使用埒环境基本上不具备GMP厂房 埒条件。园此如果检浏埒试齐I要求比较高在GMP厂房戎在一个标准埒PCR实脸室里而才能做得比校合格而在一个现有 埒实脸室，虽然逋过脸收但就足环境

7、要比GMP厂房要求珞环境差，所以两个应该有同步性。就就足说在GMP厂房好硯条件 下生产捋试剂放到现有埒实脸室里而也应该埒對同样一个实脸结果。如果我们现在埒实脸条件出现了交叉性I?污染问 题.即我们环境里面就存在一个16sRNA这样得苗株那我们现有得检测结果就没有可韮性。（二）敏感性一个好埒试剂要有好埒敏感性。有碍专家想通过增加換块扩增捋董来提高敎感性我们认为就是不科学埒从低礦 埒境地来讲也就足不科学埒。目前我们所做埒实脸，加入換板埒童就是微童珞，有埒就足3ul,有珞就是5ul,最多倚技是 10ub常规得应用PCR反应体系一飪就足3050uU 一些进口埒试刑用了 100ul.这样成本实际价格也非

8、常高。我们现 在3050ul埒反应体系下，一毗按板埒童在510ul就足够如果从510ul变成了 1020ul,虽然可以提高1倍倚敏 感性.但就足里面埒干扰物用会相应埒增加，够响结果埒准确性。（Dir增效率试剂本身得扩增效半应该就是最隹埒扩增效半对捡测棧板所设定珞引物与探针得位莊不呢一，它有好多位迄，好 多序列郴可以仪计.但就是在不同得区战没计捋不同引物与探针，它扩增得效半可能有很大得差别对于一个势力雄厚 或有经脸埒实体公司常常就足设计很多条引物与探针并丘綸确到个别碱基，然后通过埋论.秋件，更重奂要通过实跃珞 筛选.筛选出活性效牟比较最高埒一套引物与探针来制作试刑。在整个PCR扩增反应得效牟与敏

9、感性上我们把它比成 就足跑步与跳离埒关系.如图三所示。这就足典型得一个PCR扩增实时荧光曲坂，扩了 45个循环。我们可以瞧到从扩增得初期在没有荧丸 信号埒惭况下逐渐扩增扩增M 12个循环6脸浏到了 FH性捋扩增信号这个信号越来越救大.然后在10个住号左右达對 平台期。这条蓝线就足基线即为CT值从第一个循环到第十二循环没有跑步，十二个徘环之6开始跑,起到就近也就足 最快埒童就足最犬埒。再上6报个锲板里，含童杲低得在杲后也达到了换限这就就是跑步。跳离就就是达到平台，董掖 大埒标本，这个反应孔达到一个高平台，童报少埒反应孔也应该达到与童捉大?同样一个平台度，这就就足跳髙。不管原 始換板童离中或低一个

10、好捋试剂应该以同样埒比例与速半往前移，移列说快，即跑帑球快同时跳得球高。箍后含童撤低 埒这个反应孔也要跳到同样埒高度这就是一个好试刑埒标准。曾经对国内得试剂进行一个考核比校.发現同样一个高中 低捋棧板，按服理论扩增时，有得试剂扩增效半开始跳埒还很离后来越跳越擾，这个实体生产厂寧在探针沒计合成或它 埒用董、比例、數董等有问理，Taq晦埒活性也非常重妥。图三：Amplification PlotsArYipilicatiOn Plots添加剂.目前为了防止扩增污染埒，好多试刑公司，也括卫生临脸中心也要求，在实脸磅反应体系要加入一些UNG 酶 UNG酶可以有效埒防污熹但就足UNG酶在防汚東捋同时在9

11、5C 35分外要对它进行灭活，否则它会影响以 后捋扩增o95 C 35分钟能不能把UNG酶灭活？后来我们做了 一些实脸发现95 C5分艸很班彻底埒把UNG酶灭活. E）此它埒存在对试剂捋敎感性产生了够响，特别就是対低拷贝反应孔捋扩增产生抑制埒作用。另外关于内标珞问題，一个 好埒实脸结果.最重要埒体现在重复性上，虽然敏感性越离越好，但就足更重要埒还就足重复性，临床医生更注重同一个 标本在不同次捡测应该茯得同样一个值虽热在基检测里不可能达到完全和同，但至少要在一个范国之内。（三）更复性影响重复性埒园素有很多。第一 仪器间硯基异，能够拿對临床应用埒这些仪琴间那差异不就足牯别大，但就足在 仪筹使用过程

12、中会有好多彭响素。仪鴛使用不当、电压不穗或维护不当常常导致不同台仪若珞差异比较大。仪器埒厂 家要及时对仪器进行绒护、保养。第二，桶助仪器离心机、移涼器等对于微董帑实脸比校重要。对于需要蒿心沉淀 或提纯埒实脸.离心机埒转連与定仪时何要准，离心机埒校准也非常重要。第三，实脸室硯环境，包括空何环境与结构环境, 为了防止污棗尽可能奂做一个物理得分割也就就足核酸埒提取、扩增与试刑配制要通过扬理分剖得方式分开。第四，实 脸室埒温度円Trizol试剂 来沉淀或提取RNA如果冬天外界温度比校低，Trizol就会结晶、沉淀，它裂 解病#猫效 半就要明旻埒低下这时经常出现假阴性。第五，操作人员就足非常重要得一个因

13、素，不同单位很难进行规范统一珞一个 方而就就足採作人员捋专业素用问題如图四所示跳埒高度都不一样如果杷基线放對不同珞位狂结果就不一样，圄为 有些地方出现交叉。这虽，咚就足不同埒反应孔单孔来唯还就足一个典型珞S型曲线。但就足荧光PCR定童时4个标准 品戎者3个标准品，它就足同时形成一个标准曲线.生成一个定童得尺度范国，然后来定董此我们更强洞不同得及应孔 放在一块儿进行分析要求不同埒反应孔之间柳就是平行埒，也就就是说撤后应该就足同样硯一个效牟。图四为：PCR扩增曲三. 质量环节（一）檯酸提取方法（核酸丢失）得彩响不同单位用沟买埒试剂盒进行操作埒过程中即核酸提取捋过程就足影响用童埒一个重妥得原。对荧丸

14、定董来 说标本里埒核駿蚤埒变化应该就足唯一董埒变化，和应磅其她过程不应徴有童?变化，这才就足一个标准。PEG6000、 芨柢T等浓缩法：变董多如禹心逵度及时间.去上濟、裂解液加入量、混勺程度差异等均导致垓酸丢夫。如果除了需 要捡浏得換板董变.在我们使用过程中乂字致了检浏捋物用里俘童发生変化定童捋结果会攵列很大磅影响。核酸提取帑 方法有好多.目前最常用捋就足热裂解捋方法。丙肝病#或甲流H1N1埒检浏常用层析柱，还有目前魅来越流行用缴殊确方法祓动吸附。TRIZOL埒方法逐渐被洶 汰因为一就足它有#二就足它丢失埒核酸比较多。近几年又出现 血漬jt按加入法（核酸释放剂）目前主要就是有四 种：第一就足聚

15、乙二醇即热裂解法；第二就足层析柱硯方法；第三就足 繼珠捉纯法：第四就是TRIZOL沉淀提地法；第 五就足 血清直接加入法（核酸釋放齐|） 这些方法除了第五种没有丢失但第五种存在把如育加进去就足不就是有干抚物 用埒问题，前四种都有核酸埒丢失.（-）PEG槌取法核酸丢失情况我们对PEG捉取法核酸丢失悄况 做了一些实脸，它珞做法就是先Jfl 100ul轧解液A与10Oul得血清混.匀焦后离 逵禹心.把上洽液去丼去丼得上淸液就是不就是还有病#?然后杷去丼得上浦液再做同样得过程，发现上淸涼不但有丢 失而JL丢失捋很多。如图五所示.2X10.4X106 、1X10 . 1X10 四个不同浓度埒血浦通过PE

16、G提取法得方法. 把离心之后去丼埒上淸液再做一个捉取结果发现红色就足上淸液检浏埒童蓝色就足原液，相应硯丢失牢分别为5、8%、 24、8%. 16. 0%、16. 7%.图五为PEG提取法核鹼丢失悄况丢失卑上淸去丼后对沉淀得物用加入城性裂解液进行吹打混匀然后潅沸再离心.试剂盒埒奂求就是腋荡混匀，但就足把 吹打混匀与腋荡混匀埒结果进行对比如图六左所示：蓝柱就是吹打混匀红柱就是振荡混匀.吹打混勺埒到痔童相对要 离一些.可见先吹打再淞沸比简单得震荡淀匀要充分得多。为振荡不能将沉淀埒叛粒完全振开，自然裂解就不充分。B）此上淸液埒丢失，与沉淀颗粒埒混匀方式对结果影旳还就足比校大埒从图上可以也到对于第次方得

17、丢失牟拄 至可达百分之百。图六为吹打混匀与友荡混匀得比校（三）虽析征核酸丢失情况下面对HCV RNA核酸捉取常用埒层析柱方法进行研究发现有两个丢失得步驟 一，标本通过加盐？I解后要过层析 柱过层析柱后滤下来碍部分液体，里而就是否有核酸？我们做了连续4次埒过濾，遞下来第一遞争出来，再述第二濾，共 做四次於危再分别定童结果如图七所示。滤液一为1 32X10 ，滤涼二为3、95X10，濾液三1 X10滤浹四为1X 6 。固此可以晦出过滤过程垓酸得丢失程度还就是非能严重得。滤完后层析柱通过洗涤液仏 注涤涼B进行馬心、洗涤， 洗涤过程埒丢失这里先不考爲。单也最后一步洗忧过程，此处妥加50ul洗脱涯对层析

18、膜上磅核酸进行洗忧。第一次加50ul离心洗比磅部分为第 一份。焦怎再加50ul洗出第二份，依次连续洗四次。最兴得出硯数据与朋才硯基本一致也有Uii 20%50%埒丢失。图七为层析柱核酸丢失情况l.)206如果将两次埒丢失亞加，就有近乎80%100%埒丢夫，当热中何还有两次洗涤还没计算在内。由此可见层析柱停方 法核酸得丢失就是非常明星埒，丢失半为一倍以上。如果标本与标准品埒提取就是同步遥行埒.那么这种定童得结果还就 是具有可比性埒。但现在得试剂盒中标准品往往就是不参与提取埒也就就是标准品不丢夫，而标本却丢夫严重倚,这时 要注意如果标准品就是通过WHO定标得标准品，那么检测到埒实际值应徴就是偏低痔

19、。四）其舱彩响因素当热对实脸结果得影响还有包括仪2S埒差异不同采光埒原埋、光源埒强度。这里要钱调光源碍钱度，为荧光PCR 仪器就足通过光源照射以后来激发检浏得，那么该光涌就足有一定好金埒,如果光源使用时间比校长，光亮度不够那么 检浏埒信号也相应会比校弱一些。这对实脸捋结果牯别就是对辐阳性埒结果影响会比较大。最6还有专业人员操作猫 -个差异也会对结果造成够响。园此对结果埒影响E）素卩余了试刑盒埒质童以外，实脸室倚环境、操作人员得素用，包括试列操作方法碍差异，林就 是影呦实脸结果得重要圄素。待別就足不同帑提取方法，知聚乙二醇法、层析柱法与没有捉到埒離珠法.同样存在因被动 吸附引超埒丢失埒问題。而这

20、些祁会影响到整个实脸埒均一性。哪些因素影响PCR荧光定量得实验结果?思考四、汚染与仿汚染播施大字也许知道1998年时PCR脸测技术在国内基本上裁是停用帑，主要原因就是当时在国内用磅比较乱，有些乡恨 医院也做PCR检浏也可以有一个跑电泳埒房间通过电泳结果来出临床报告。当时很多实脸室做什么试脸柳就是阳性埒， 也就就足说当时得污染非常严重。匕98年停用以馬经过几年捋整頼卫生部要进行严格倚PCR实脸室脸收同时进行 人员培调以及对试剂逐渐过渡到荧芜PCR 通过一个何管捡浏珞方式，大大减少了污染。但就是目前污熹还就是存在，主要 原圄就是核酸捉取还就是开放性捋.同时产物络处理还不严格。更重要埒就足试剂盒里而

21、得标准品都就是阳性埒揍板.有 得就足用粒有捋就建合成得序列，有得就足血洽.不管就足怎样都就足阳性痔物质，因此常常也就是汚東珞重要来液。目前实脸室防污熹主要就是，一彷止核酸提取过程埒外;世；二在试刑配制得过程中防止标准品倚污哀;三要防止产 物埒外泄。实脸室妥严格埒分区管理就就是物理隔宙，核酸提取与试剂配制不能在一超试剂配制奂尽可能在核酸提取 得前方人员与用得扬苗要完全不同就就足不要把核酸提取得扬苗带到试剂配剖室里去。要通过严格埒分区，工作瞳与 使用器具好史換来达到相互不污染埒目埒.其次奂严格碍实脸室通凤，一定要有对流风.有得实脸室为了达到这个通風，可以安装排凤角。实脸室埒通风就 是彷污棗埒非常重

22、要得方法。不要腊望把污熹物用给溝丼而就是应该把它污染从实脸室赶走。通过通凤埒方式把实脸 室里面埒污染物用帝走这就是最有效埒方法。实脸室设计最早埒实脸室设计就足一个闭风埒秋态，現在都变成了一种通 凤埒秋态另外有效埒消#对防污乗也有作用不管就是提取珞核酸还就是扩增硯产物。包括84消#涼，健之素等都可以 对序列超到玻琏埒作用。对实脸室确揉作台与其他扬苗，只要就足不怕水耐腐烛椰要通过有效範消#液进行浸泡、擦拭 扯后清水洗净埒方法来浒洁.通过一些实脸室也发現酒耕擦反或通过高压处理得方式椰达不到清除污染痔一个目得。0 为高压只能把活埒东西压死对加苗灭茵就是有效得，但对序列就很炬At链。紫外线服射也就足如此

23、，虽然对产物有一定 埒破怯作用但就是对提取埒核酸大片断硯败琏效果还就是校差埒。最后人员培洌也非常重要，对于以前没有这方而唸识埒人员得培洌必不可少.不具备務汚条意识得人员尽可能不 要掠作实脸。产生污染得原因有哪些？如何防止污染得产生?思考五、关于内标得讨论（一）实时荧光定* PCR无需内标实时荧光定董PCR技术有效地解决了传统定董只能终点检浏得局限实现了每一轮循环均栓浏一次荧光信号硯衣 度.并记录在软件之中通过对每个样品Ct值得计算，根据标准曲线获埒定董结果。（Dot值得重现性PCR第环在列达Ct值所在得循环秋时刚刚进入真正得指戟扩增期（对戟期），此时徵小误差葡未放俎因此Ct值得 直现性极好即同

24、一換板不同时间扩增戎同一时间不同管内扩增硯到珞Ct值就足也定硯。Ct值与是始模板得钱性关系由于Ct值与起始棧板得对戟存在线性关系，可利用标准曲线对未知样苗进拧定童测定固此实时荧光定量PCR .it 是一种采用外标准与标本同步进行核酸提取埒曲煤定童方法。（二）内标对实时荧光定走PCR得影响若在待浏样品中加入已知恳始拷贝数埒内标，則PCR反应変为班重PCR. PCR反应中存在两种歿板之何得干扰 与竞卜尤其当两种挾板埒恳始拷贝敛相差比较大时，这种竞护会表现磅更为显著。但由于待浏样品得起始拷貝数就是未 知埒所以无法加入合适敛董得已知模板作为内标。正因如此，定童方法虽然加入内标，仍为一种半定童方法。美国

25、Texas大学捋科研人员进行了外标法定童与内标法定童珞方法学比较，I?出埒结论就建：内标法作为定童或 半定童埒手段就是不可龛埒而外标准曲线得定童方法就是一种准确埒、值硯信戕硯科学方法。Applied Biosystems公司埒7700型实时荧龙定f PCR仪就足全球公认得荧龙定童PCR埒全标准，可实现多色荧 光同时捡浏但定董捡浏仍热采用外标准曲线捋方法，而不用内标进行定童。（三）内标得失败率我们对采用3家公司考核试剤内标夫敗半进行分析3察试剂得内标均存在内标失败埒悄况但各不相同阳性标本 埒失败半在3、2%16、5% ;阴性样本碍內标失败率在457、2%，高于COBAS碍失敗牟（仁7% 11/6

26、0） 捋入内标埒 童大多为5X103左右我们采用PEG与直接加入两种方法対2X103 ? HBV阳性血溝进行96孔重复核酸提取，夫敗 半均为0。内标现在有两奚，一类就足内标定童罗氏C06AS TaqMan 就就是内标定童，在每管里枷有一个内标，该内标就 是一定董得它来做为一个定董点，标本扩增曲线埒Ct值与内标按照3、3得一个比例关系来进行内标定量。另一奚就是 提取内标，国内现有埒内标都不就是定董内标，而就犬提取?内标，也就就是在提取珞过程中加入一个定董碍内标与要提 取埒标本同时进行提取。对内标埒要求本应就是核酸埒歿板就是多少童.内标应该也加多少，做到公平竞爭.而实际上要浏捋锲板埒童未知, 圄此很雄做到加入多少内标.而现在大多敛柳加入等童内标.来浏不同含童珞标本里埒核酸埒童。因此就出现了，比如1 X10 得換板核酸埒标本.用5X103次方得内标时，出现内标失敗。虽然认为汚染也不会污棗到1X10但毕竟内标珞夫 败也就失去了意义同样