因工程及其在食品工业中的应用2013

1、食品生物技术第五章第五章 基因工程及其在食品工业中应用（基因工程及其在食品工业中应用（6）第六章第六章 细胞工程及其在食品工业中应用（细胞工程及其在食品工业中应用（4）第七章第七章 生物技术与食品安全和品质控制（生物技术与食品安全和品质控制（2）第八章第八章 生物技术在食品工业废水处理中应用（生物技术在食品工业废水处理中应用（2）席 俊第五章第五章 基因工程及其在食品工业中的应用基因工程及其在食品工业中的应用The application of Genetic Engineering in Food Industry主要内容基因工程概述基因工程概述工具酶工具酶目的基因目的基因基因载体基因载体基

2、因重组基因重组基因的转化、增殖和表达基因的转化、增殖和表达基因工程在食品工业中的应用基因工程在食品工业中的应用 蛋白质工程蛋白质工程 第一节第一节 基因工程概述基因工程概述基因的概念和本质基因的概念和本质：具有生物学功能的具有生物学功能的DNADNA中的一个片段，是中的一个片段，是生物体遗传和变异的基本单位。生物体遗传和变异的基本单位。基因的本质是基因的本质是DNADNA（一）基因工程的概念：（一）基因工程的概念： (Genetic engineering)(Genetic engineering)用用酶学酶学方法，将异源基因与方法，将异源基因与载体载体DNADNA在体在体外进行重组，将形成的

3、重组子转入受体细胞，外进行重组，将形成的重组子转入受体细胞，使异源基因在其中复制表达，从而改变生物使异源基因在其中复制表达，从而改变生物特性，大量生产出人类所需要的产物的高新特性，大量生产出人类所需要的产物的高新技术。技术。 基因工程又称为：基因工程又称为：分子克隆（分子克隆（Molecular Cloning)基因克隆基因克隆(Gene Cloning)分子重组分子重组(Molecular Recombinant)遗传工程遗传工程(Genetic Engineering)基因操作基因操作（Gene Manipulation） 食品基因工程：食品基因工程：利用基因工程的技术和手段，在分子水利用

4、基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗传物质，以改良食品的平上定向重组遗传物质，以改良食品的品质和性状，提高食品的营养价值、贮品质和性状，提高食品的营养价值、贮藏加工性状以及感官性状的技术。藏加工性状以及感官性状的技术。外源外源DNA在寄主细胞内可大量扩增，在寄主细胞内可大量扩增，和高水平表达。和高水平表达。1. 跨物种性跨物种性2. 无性扩增无性扩增外源基因到另一种不同的生物细胞内外源基因到另一种不同的生物细胞内进行繁殖。进行繁殖。（三）基因工程的特征（三）基因工程的特征（四）基因工程的发展概况（四）基因工程的发展概况一、基因工程诞生的理论基础1 . DNA是遗传物质是遗传物质1952

5、年年Alfred Hershy和和Marsha Chase进一步证明进一步证明遗传物质是遗传物质是DNA。1944年年 Avery，确定确定了基因的分子载了基因的分子载体是体是DNA，而不是蛋白质。，而不是蛋白质。（1）肺炎双球菌转化实验（2）噬菌体转染实验1953年年James D. Watson和和Francis H. C. Crick揭示了揭示了DNA分子的分子的双螺旋结构双螺旋结构和和半保留复制机制半保留复制机制。2. DNA双螺旋结构1957年年Crick又提出了遗传信息传递的又提出了遗传信息传递的“中中心法则心法则” DNA RNA protein1964年年Marshall Ni

6、renberg和和Gobind Khorana等终于等终于破译了破译了64个遗传密码个遗传密码.3. 中心法则和遗传密码二、基因工程诞生的技术突破1. 限制性内切酶（限制性内切酶（restriction enzymes）1970年年H.O. Smith等分离出第一种限制等分离出第一种限制性核酸内切酶。性核酸内切酶。Werner Arber 理论预见限制酶理论预见限制酶Daniel Nathans 用限制酶切得用限制酶切得SV40 DNA片断片断Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶得到第一个限制酶1978年年Nobel生理或医学奖生理或医学奖2. DNA连接酶（连接酶（ligas

7、e）1967年年5个实验室几乎同时发现了个实验室几乎同时发现了DNA连连接酶。接酶。3. 载体（载体（vector）1972年前后使用小分子量的细菌年前后使用小分子量的细菌质粒质粒和和 噬噬菌体菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。作载体。在细菌细胞里的大量扩增。4. 感受态体系感受态体系1970年年M. Mandel和和A. Higa发现经过发现经过氯化氯化钙钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年年S. Cohen发现这种处理过的细菌同发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒样能吸收质粒DNA。5. 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可

8、将不同发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的长度的DNA分离开。分离开。6. DNA测序技术测序技术1975年年F. Sanger、A. Maxam和和W. Gilbert发明了发明了DNA快速测序技术。快速测序技术。1980年年Nobel化学奖化学奖三、基因工程的诞生1980年年Nobel化学奖化学奖1972年斯坦福大学的年斯坦福大学的Paul Berg小组完成小组完成了首次体外重组实验：了首次体外重组实验：1. Berg的开创性实验的开创性实验将将SV40的的DNA片断与片断与 噬菌体的噬菌体的DNA片断连接起来。片断连接起来。（用（用DNA末端转移酶，末端转移酶，而非限制性内切酶）而非限制

9、性内切酶）2. Boyer-Cohen实验 1973年斯坦福大学的年斯坦福大学的S. Cohen小组将含小组将含有有卡那霉素抗性卡那霉素抗性基因的大肠杆菌基因的大肠杆菌R6-5质粒质粒与含有与含有四环素抗性四环素抗性基因的另一种大肠杆菌基因的另一种大肠杆菌质粒质粒pSC101连接成重组质粒，具有连接成重组质粒，具有双重抗双重抗药性药性。 后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同后来又把非洲爪蟾核糖体基因片断同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的菌体内成功转录出相应的mRNA。这是。这是第一次成功的基因克隆实验。第一次成功的基因克隆实验。Stanle

10、y Cohen 1986 Nobel生理生理或医学奖或医学奖Herb Boyeru19861986年，美国和英国科学家首次进行了抗除年，美国和英国科学家首次进行了抗除草剂转基因烟草的田间实验。草剂转基因烟草的田间实验。u此后此后，基因工程技术迅猛发展，已经在农业、，基因工程技术迅猛发展，已经在农业、医药、食品、环保等领域显示出巨大的应用医药、食品、环保等领域显示出巨大的应用价值。价值。四、基因工程的迅速发展阶段基因工程的迅速发展阶段u20122012年全球的转基因作物种植面积有年全球的转基因作物种植面积有亿公顷亿公顷，比，比20112011年增长年增长6%6%。u20122012年美国仍是全球

11、领先的转基因作物生产者，种植年美国仍是全球领先的转基因作物生产者，种植面积达面积达69006900万公顷，主要转基因作物的平均种植率约万公顷，主要转基因作物的平均种植率约为为90%90%。（中国第六）。（中国第六）u全世界转基因作物按种植面积排序分别为全世界转基因作物按种植面积排序分别为玉米、大豆玉米、大豆、棉花、油菜籽。棉花、油菜籽。u我国的农业基因工程研究于我国的农业基因工程研究于2020世纪世纪8080年代初期开始启年代初期开始启动，并于动，并于2020世纪世纪8080年代中期开始将生物技术列入国家年代中期开始将生物技术列入国家“863”863”高科技发展计划。高科技发展计划。u我国正在

12、研究的转基因植物种类达我国正在研究的转基因植物种类达4747种以上，涉及各种以上，涉及各类基因类基因100100多个。多个。u目前我国被批准进行商品化生产的目前我国被批准进行商品化生产的6 6种转基因植物种转基因植物：转：转基因耐贮藏的番茄、转查尔酮合成酶基因矮牵牛、抗基因耐贮藏的番茄、转查尔酮合成酶基因矮牵牛、抗病毒甜椒、抗病毒番茄、抗虫棉花和保龄棉等。病毒甜椒、抗病毒番茄、抗虫棉花和保龄棉等。五、我国基因工程的发展概况我国基因工程的发展概况世界各国转基因作物大田释放情况转基因作物特性转基因作物特性批准项数批准项数所占比例所占比例抗除草剂抗除草剂129729.6%抗虫抗虫104623.8%产

13、品质量高产品质量高88620.2%抗病毒抗病毒4369.9%农学性状好农学性状好2114.8%抗真菌抗真菌2084.7%其它其它3036.9%中国已经批准进入大田的转基因植物转基因植物转基因植物特性特性申请单位申请单位获批准数获批准数马铃薯马铃薯抗病毒抗病毒中科院中科院4抗病抗病中国农科院中国农科院1抗逆抗逆北京大学北京大学1高营养品质高营养品质北京大学北京大学1水稻水稻抗虫抗虫中科院中科院1抗病毒抗病毒北京大学北京大学2抗病抗病农科院农科院2抗除草剂抗除草剂水稻所水稻所1棉花棉花抗虫抗虫中科院中科院 农科院农科院 美国孟山都公司美国孟山都公司9玉米玉米抗虫抗虫美国孟山都公司等美国孟山都公司等

14、3大豆大豆抗除草剂抗除草剂农科院农科院1小麦小麦抗除草剂抗除草剂北京农林科学院北京农林科学院1高营养品质高营养品质北京农林科学院北京农林科学院1番茄番茄抗病抗病北京大学北京大学1耐储存耐储存中科院中科院 华中农大华中农大3 甜椒甜椒抗病抗病北京大学北京大学1辣椒辣椒抗病毒抗病毒中科院中科院烟草烟草抗病毒抗病毒北京大学北京大学抗虫抗虫中科院中科院 北京大学北京大学番木瓜番木瓜抗病毒抗病毒中国热带作物中国热带作物广藿香广藿香抗病抗病农业科学学院农业科学学院矮牵牛矮牵牛改变花色改变花色北京大学北京大学杨树杨树抗虫抗虫中科院中科院微生物微生物提高固氮效率提高固氮效率中科院中科院 农科院农科院 华中农大

15、华中农大 广东微生物所广东微生物所（五）基因工程的安全性（五）基因工程的安全性制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力制造带有抗生素抗性基因或有产生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人类或其它生的基因的新型微生物有可能在人类或其它生物体内传播。物体内传播。1. 对环境的影响对环境的影响2. 新型病毒的出现新型病毒的出现重新组合一种在自然界尚未发现的生物性状重新组合一种在自然界尚未发现的生物性状有可能给现有的生态环境带来不良影响。有可能给现有的生态环境带来不良影响。一、基因工程的安全隐患将肿瘤病毒或其它动物病毒的将肿瘤病毒或其它动物病毒的DNA引入引入细菌有可能扩大癌症的发生范围。细菌有可能扩大癌

16、症的发生范围。4. 人造生物扩散人造生物扩散新组成的重组新组成的重组DNA生物体的意外扩散可能生物体的意外扩散可能会出现不同程度的潜在危险。会出现不同程度的潜在危险。3. 癌症扩散1. 公众的担忧公众的担忧二、重组DNA研究的安全准则1973年年美国的公众美国的公众第一次公开表示担第一次公开表示担心应用重组心应用重组DNA技术可能会培养出具技术可能会培养出具有潜在有潜在危险性的新型微生物危险性的新型微生物，从而给，从而给人类带来难以预料的后果。人类带来难以预料的后果。1974年美国年美国国立卫生研究院国立卫生研究院（NIH）考虑）考虑到重组到重组DNA的潜在危险，提请的潜在危险，提请Paul

17、Berg博博士士组成一个重组组成一个重组DNA咨询委员会咨询委员会。这个由这个由1111名分子生物学和重组名分子生物学和重组DNADNA权威学者组成的委权威学者组成的委员会在同年员会在同年7 7月发表公开信（月发表公开信（science,158,303)science,158,303)，要，要求在求在没有弄清楚重组没有弄清楚重组DNADNA所涉及的危险性范围和程度，所涉及的危险性范围和程度，以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验以及在采取必要的防护措施之前，暂停两类试验（带带抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒抗生素抗性和肿瘤病毒及动物病毒）。）。2. 专家的态度1976年年6月月23日，日，N

18、IH正式公布了正式公布了“重组重组DNA研究的安全准则研究的安全准则”。规定了规定了安全防护（物理防护和生物防护）安全防护（物理防护和生物防护）标准标准以及以及禁止禁止若干类型的实验。若干类型的实验。 1979年、年、1981年、年、1989年年NIH又做了多又做了多次修改，放宽了许多限制。次修改，放宽了许多限制。分分4级：级：P1P4级。级。（1）实验室的物理安全）实验室的物理安全4. 基因工程的安全措施一般装备良好的普通微生物实验室。一般装备良好的普通微生物实验室。 P1级实验室级实验室 P2 级实验室级实验室在在P1级实验室的基础上还装备有级实验室的基础上还装备有负负压压的安全操作柜。的

19、安全操作柜。全负压全负压的实验室，同时装备安全操作柜。的实验室，同时装备安全操作柜。 P4级实验室级实验室专用的实验大楼专用的实验大楼，周围与其它建筑物应，周围与其它建筑物应有隔离带。有隔离带。 具有最高安全防护措施。具有最高安全防护措施。 P3 级实验室在自然环境中在自然环境中无法无法存活。存活。（2）实验室的生物安全分分3 级（大肠杆菌）：级（大肠杆菌）：EK1EK3级。级。 EK1级的大肠杆菌级的大肠杆菌在自然环境中在自然环境中一般一般都要死亡。都要死亡。 EK2-EK3级大肠杆菌级大肠杆菌第一个第一个“安全安全”菌株是菌株是K12（1976年），很不实用，已淘汰。年），很不实用，已淘汰

20、。（3） 载体的安全应该是失去了应该是失去了自我迁移自我迁移的能力。的能力。不会自动从不会自动从“安全安全”的菌株转移到的菌株转移到“不不安全安全”的菌株中。的菌株中。 （容易构建）。如（容易构建）。如pMB9，pBR322等。等。主要内容基因工程概述基因工程概述工具酶工具酶目的基因目的基因基因载体基因载体基因重组基因重组基因的转化、增殖和表达基因的转化、增殖和表达基因工程在食品工业中的应用基因工程在食品工业中的应用蛋白质工程蛋白质工程 第二节第二节 工具酶工具酶 The Enzyme of ToolsThe Enzyme of Tools 工具酶的定义：工具酶的定义：在 基 因 操 作 中

21、应 用 的 酶 统 称 为 工 具 酶在 基 因 操 作 中 应 用 的 酶 统 称 为 工 具 酶（Enzyme of toolsEnzyme of tools），到目前为止常用的工），到目前为止常用的工具酶有具酶有300300多种。多种。例如：限制性内切酶、聚合酶、反向转录酶例如：限制性内切酶、聚合酶、反向转录酶和碱性磷酸酯酶等。和碱性磷酸酯酶等。是一类专一性很强的核酸内切酶。是一类专一性很强的核酸内切酶。识别并切割特异的双链识别并切割特异的双链DNADNA序列的一种内切序列的一种内切核核酸酶酸酶。一一 限制性内切酶：限制性内切酶：(Restriction enzyme) 在生物体内有一类

22、酶，它们能将外来的在生物体内有一类酶，它们能将外来的DNADNA切切断，即能够限制异源断，即能够限制异源DNADNA的侵入并使之失去活的侵入并使之失去活力，但对自己的力，但对自己的DNADNA却无损害作用，这样可以却无损害作用，这样可以保护保护细胞细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用原有的遗传信息。由于这种切割作用是在是在DNADNA分子分子内部进行的，故名限制性内切酶内部进行的，故名限制性内切酶( (简称限制酶简称限制酶) ) ( (一）限制性内切酶的种类：一）限制性内切酶的种类：根据限制酶切割的特点，可将它们分为根据限制酶切割的特点，可将它们分为两大类：一类是切割部位无两大类：一类是切割部

23、位无特异性特异性的；的；另一类是可特异性地识别核苷酸序列，另一类是可特异性地识别核苷酸序列，即只能在一定的即只能在一定的DNADNA序列上进行切割序列上进行切割 。I类分子量大，大于30万U，用处不大；IIII型相对较小，约在型相对较小，约在2-102-10万万U U，专一性强，识，专一性强，识别准确（识别序列和切割序列相一致）。已分别准确（识别序列和切割序列相一致）。已分离出离出300300多种。多种。EcoRIEscherichia coli(大肠埃希氏菌）大肠埃希氏菌）HindII, IIIHaemophilus influenzae( (流感嗜血杆菌）流感嗜血杆菌）( (二）限制性内切

24、酶命名原则：二）限制性内切酶命名原则：采用获得该酶的微生物的采用获得该酶的微生物的属名属名和和种名种名的词头字的词头字母组成的。即取属名的头一个字母（大写）和母组成的。即取属名的头一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）写成斜体字的三个种名的前两个字母（小写）写成斜体字的三个字母的缩写，字母的缩写，菌株名菌株名以非斜体符号加在这三个以非斜体符号加在这三个字母的后面。若同一菌株中有不同的限制性内字母的后面。若同一菌株中有不同的限制性内切酶时，则以罗马数字加以区别。切酶时，则以罗马数字加以区别。例如：例如：HinHind IIId III表示从表示从Haemophilus Haemophilus

25、 influenzaeinfluenzae（流感嗜血杆菌，指来源）菌株（流感嗜血杆菌，指来源）菌株d d中分离出来的第中分离出来的第3 3种限制性内切酶。种限制性内切酶。又如，又如，EcoEcoR I R I 和和EcoEcoR IIR II分别表示从分别表示从Escherichia coliEscherichia coli（大肠埃希氏菌）菌株（大肠埃希氏菌）菌株RY13RY13中分离出的第中分离出的第1 1种和第种和第2 2种限制性内切酶。种限制性内切酶。（三）限制性内切酶的特性（三）限制性内切酶的特性: :1 1、各种限制性内切酶能专一的识别碱基、各种限制性内切酶能专一的识别碱基顺序，从顺

26、序，从5-35-3一般识别顺序为一般识别顺序为4-64-6个个碱基对的长度。碱基对的长度。 EcoR GAATTC Hind AAGCTT2 2、识别序列皆具有回文结构，、识别序列皆具有回文结构，也就也就是在切割部位，一条链正向读的碱是在切割部位，一条链正向读的碱基顺序与另一条链反向读的顺序完基顺序与另一条链反向读的顺序完全一致全一致 。（三）限制性内切酶的特性（三）限制性内切酶的特性: :（三）限制性内切酶的特性（三）限制性内切酶的特性: : 3 3、切割后形成各种粘性末端或平整末端、切割后形成各种粘性末端或平整末端 （1 1）粘性末端）粘性末端 (cohesion ends)(cohesi

27、on ends)：限制性内：限制性内切酶错位切割切酶错位切割DNADNA双链而形成彼此互补的单双链而形成彼此互补的单链末端，（或者两条链的切点是交错的）链末端，（或者两条链的切点是交错的）称为粘性末端。称为粘性末端。例如：EcoR I的识别序列及作用点： 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 EcoR I 粘性末端 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 粘性末端（2 2） 平整末端平整末端(flush ends)(flush ends)：在同一位点平齐：在同一位点平齐切割切割DNADNA两条链而形成的双链末端，（或者说两两条链而形成的双链末端

28、，（或者说两条链的切点是平的）称为平整末端。条链的切点是平的）称为平整末端。 如如Hpa IHpa I酶的识别序列与作用点酶的识别序列与作用点 5-G T T A A C-3 3-C A A T T G-5 Hpa I 5-G T T + A A C-3 3-C A A T T G-5 平整末端平整末端（三）限制性内切酶的特性（三）限制性内切酶的特性: : 4 4、切割后形成异源二聚体、切割后形成异源二聚体 有的限制性内切酶识别位点和序列不同，但有的限制性内切酶识别位点和序列不同，但对对DNADNA切割后产生相同的粘性末端。切割后产生相同的粘性末端。二二 、DNADNA连接酶（连接酶（Liga

29、sesLigases） （一）主要有大肠杆菌（一）主要有大肠杆菌DNADNA连接酶和连接酶和T T4 4-DNA-DNA连接连接酶酶（二）特点：需要辅助因子，如：大肠杆菌（二）特点：需要辅助因子，如：大肠杆菌DNADNA连接酶是连接酶是NADNAD+ + 而而T T4 4-DNA-DNA连接酶是连接酶是ATPATP（三）连接酶的作用（三）连接酶的作用 ： 使外源目的基因片段和载体质粒使外源目的基因片段和载体质粒DNADNA片段在体片段在体外连接形成重组外连接形成重组DNADNA分子。或者说催化分子。或者说催化DNADNA分分子中相邻的子中相邻的5-5-磷酸基末端和磷酸基末端和3-OH3-OH末

30、端之末端之间连接形成磷酸二酯键。间连接形成磷酸二酯键。（四）应用：连接各种粘性和平整末端（四）应用：连接各种粘性和平整末端 5AATTC-G 5 AATTC-G G-CTTAA 5 G- CTTAA 5 5 AATTC-GAATTC-G G-CTTAAG-CTTAA 5 T4连接酶ATP二二 、DNADNA连接酶（连接酶（LigasesLigases） 三三 、DNADNA聚合酶聚合酶（DNA polymeraseDNA polymerase） （一）特点：分子量（一）特点：分子量109000109000，是一条约，是一条约10001000个氨基酸残个氨基酸残基的多肽链。分子中含有一个二硫键和

31、一个基的多肽链。分子中含有一个二硫键和一个-SH-SH，此外，此外还有锌离子。还有锌离子。（二）作用机制：（二）作用机制： ndATP dTMP ndGTP DNA聚合酶 dCMP ndCTP- DNA引物 dGMP-DNA+4(n)pp ndTTP Mg2+ dAMP(三三)应用：应用：1 1、以单链、以单链DNADNA为模板，催化从为模板，催化从5- 35- 3的单核甘酸的的单核甘酸的聚合反应；聚合反应；2 2、以、以RNARNA为模板，从为模板，从5- 35- 3催化催化cDNAcDNA的合成；的合成；3 3、引物延伸和反转录。、引物延伸和反转录。 四、多聚核甘酸激酶(T(T4 4 Po

32、lynucleotide Kinase)Polynucleotide Kinase)催化催化ATPATP的的-磷酸基团转移到多聚核苷酸磷酸基团转移到多聚核苷酸的的55末端和末端和33的单核苷酸上，在某些情的单核苷酸上，在某些情况下，上述的反应可反方向进行，可以不况下，上述的反应可反方向进行，可以不必用碱性磷酸酶对底物进行脱磷酸化。必用碱性磷酸酶对底物进行脱磷酸化。应用：在DNA测序中，用于单链和双链DNA和RNA的5末端的标记。 五、 碱性磷酸酯酶（磷酸单酯酶）（Alkaline Phosphatase）（一）作用：去除（一）作用：去除55磷酸基（磷酸基（DNADNA分子上和分子上和RNARN

33、A分子上）分子上）（二）应用：（二）应用： 1 1、去除线状克隆载体、去除线状克隆载体DNADNA两端的两端的55磷酸基磷酸基团。防止载体再次连接环化；团。防止载体再次连接环化； 2 2 、在用、在用T T4 4多聚激酶进行末端标记之前切多聚激酶进行末端标记之前切除除55端磷酸基团。端磷酸基团。六、六、 S S1 1核酸酶：（核酸酶：（NucleaseNuclease）（一）（一）作用作用：可以内切单链：可以内切单链DNADNA和和RNARNA使降解为使降解为具有具有55磷酸末端的产物，只有在高浓度的情磷酸末端的产物，只有在高浓度的情况下才对双链况下才对双链DNADNA起降解作用起降解作用（二

34、）应用：（二）应用：（1 1）将具有粘性末端的双链）将具有粘性末端的双链DNADNA暴露的单链暴露的单链 部分切除部分切除（2 2）选择性降解单链）选择性降解单链DNA DNA （3 3）用于）用于RNARNA图谱分析图谱分析 七、反向转录酶七、反向转录酶（Reverse TranscriptasesReverse Transcriptases） 主要以主要以RNARNA为模板反转录合成为模板反转录合成DNADNA常用的有常用的有AMVAMV和和M-MLVM-MLV反转录酶反转录酶应用应用RNARNA指导的指导的DNADNA合成反应合成反应DNADNA指导的指导的DNADNA合成反应合成反应R

35、NARNA的水解反应的水解反应蛋白质蛋白质翻译翻译转录转录逆转录逆转录复制复制复制复制DNARNA主要内容基因工程概述基因工程概述工具酶工具酶目的基因目的基因基因载体基因载体基因重组基因重组基因的转化、增殖和表达基因的转化、增殖和表达基因工程在食品工业中的应用基因工程在食品工业中的应用 蛋白质工程蛋白质工程 第三节第三节 目的基因目的基因 Aim GeneAim Gene概念：在基因工程中，按照人们的预先设计获概念：在基因工程中，按照人们的预先设计获得所需要的特异基因，即目的基因（或称外源得所需要的特异基因，即目的基因（或称外源基因）。基因）。 目的基因得到的途径：目的基因得到的途径：1 1、

36、分离法、分离法 2 2、反转录合成法（酶促合成法）、反转录合成法（酶促合成法）3 3、化学合成法、化学合成法4 4、聚合酶链式反应（、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Polymerase Chain Reaction,Reaction,简称简称PCRPCR扩增）或无细胞分子克隆技扩增）或无细胞分子克隆技术（术（cell-free molecular cloningcell-free molecular cloning）一一 、分离法、分离法 Separation or Centrifugation method从动物、植物或微生物的从动物、植物或微生物的DNADNA分子中分离

37、得到分子中分离得到特异的基因的方法称为分离法。特异的基因的方法称为分离法。基因分离最常用和最简便的方法是将基因分离最常用和最简便的方法是将DNADNA经过经过限制性内切酶的作用，分割成片段，然后进行限制性内切酶的作用，分割成片段，然后进行电泳或密度梯度离心等方法将特异的电泳或密度梯度离心等方法将特异的DNADNA片段片段进行分离。进行分离。还可以用层析法将还可以用层析法将DNADNA片段分离，而得到所需片段分离，而得到所需的的目的目的基因。基因。 二二 、反转录合成法（酶促合成法）、反转录合成法（酶促合成法） Reverse Transcription Synthesis 首先从细胞中分离得到

38、特异的首先从细胞中分离得到特异的mRNAmRNA，然，然后以后以mRNAmRNA为模板，以寡聚脱氧胸腺嘧啶核为模板，以寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸（苷酸（oligo dToligo dT）为引物，在反转录酶的）为引物，在反转录酶的作用下，合成互补的作用下，合成互补的DNADNA（cDNAcDNA），），cDNAcDNA再再复制成双链的复制成双链的DNADNA片段。片段。 三三 、化学合成法：、化学合成法：Chemical Synthesis 概念：以单核苷酸为原料，在体外用概念：以单核苷酸为原料，在体外用化学方法按照已知基因的碱基顺序，先化学方法按照已知基因的碱基顺序，先合成合成DNADNA短片段，

39、再依次连接成完整的短片段，再依次连接成完整的目的目的基因的方法称为化学合成法。基因的方法称为化学合成法。 四四 、聚合酶链反应技术、聚合酶链反应技术 Polymerase Chain Reaction Technology 聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（Polymerase Chain Polymerase Chain ReactionReaction）简称）简称PCRPCR（19851985年发明了年发明了PCRPCR），），（无细胞分子克隆技术）。（无细胞分子克隆技术）。原理：它以单链的原理：它以单链的DNADNA作为模板，在相应的引作为模板，在相应的引物指导下，用物指导下，用DNADNA聚合酶复制出产物聚合酶复制出产物DNADNA。 主要包括：主要包括：1 1、双链、双链DNADNA的热变性；的热变性；2 2、引物与单链、引物与单链DNADNA退火结合；退火结合；3 3、引物延伸、引物延伸主要内容基因工程概述基因工程概述工具酶工具酶目的基因目的基因基因载体基因载体基因重组基因重组基因的转化、增殖和表达基因的转化、增殖和表达基因工程在食品工业中