斑点叉尾天然单链ScFv噬菌体抗体库的构建及初步鉴定

1、斑点叉尾天然单链（ScFv）噬菌体抗体库的构建及初步鉴定 摘要：以健康未经免疫的斑点叉尾为试验材料，取其新鲜外周 血，分离淋巴细胞，提取总rna，逆转录合成cdnaopcr 扩增重链fd和轻链cdna，以纯化的vh、vl基因为模板， 以与vh基因3端和vl基因一5端序列互补的linker primer mix为引物，将vh、vl随机拼接为s cfv。通过酶切连接，依次将pcr产物插入质粒p3mh相应 位点，热激法转化大肠杆菌xllblue，加入辅助噬菌体v csm 13,构建噬菌体单链抗体库。测定库容并酶切鉴定。斑 点叉尾天然单链（s cf v）噬菌体抗体库成功构建为进一步筛 选特异性抗体及从

2、斑点叉尾病变组织中提取特异性抗原用于免 疫治疗奠定了基础。关键词：斑点叉尾；抗体库；噬菌体展示；抗体单链（s cfconstruction and preliminary identification of single-chain antiboly library ofietalurus pun etausn atural phage in cha nnel catfishwang hui1 , zou shi-ping2(1. college of fisheries,huazhong agricultural,chi neseuniversity, wuhan 430070, china

3、 ;2.yangtze river fisheries reserch institute-论文发表专家- 趣|中国黠斛网 .q i kanwang ,nelmabstract:peripheralblood lyphocyteswere isolatedfrom 250 m l blood,which was obtainedfrom 50 nonimmunnizedhealthychannelcatfish through theirvena caudalis.the heavy chainfd and light chain cdna synthesized from the total

4、rna of lymphocytes were pcr amplifiedandthe amplificationproducts werecompacted by linker primermix into scfv.thenthe amplification productswere ligatedsuccessivelyinto the phagemidvector p3mh,then the ligated samPle was transformedinto competent e.coli xllblue.the transformed cells were infected wi

5、th vcsm 13 helper phage to yieldrecombinantphage s cfv antibody.the successfulconstruction of na i ve channel catfish phagA医一论文发袤专家一J中国黠斛网fwww.qikanwang. nela ntibodylibrary create d favourable conditions for selectin g specific phage antibody and a bstracting specific antigen.key words:ictalurus pu

6、nctatus rafinesque; antibody library;bacterial phage; s cfv斑点叉尾(ictalurus punctatus raf inesque )亦称沟鲶(channel catfish),属于鲶形目(siluriformes) 科(i e taluridae)鱼类。主要分布于美国中部、加拿大南部和大西洋沿岸的部分地区。斑点叉尾是水产养殖业中最为重要的养殖鱼种之 一，自2 0世纪8 0年代引进我国以来养殖规模不断扩大，出口量 也在逐年上升。但是由于斑点叉尾种质资源退化严重，养殖技术 较低，养殖环境恶化等原因，导致人工养殖的斑点叉尾病害频发， 给养

7、殖业带来巨大损失。斑点叉尾疾病防治应当坚持“预防为主, 防重于治”的原则。噬菌体抗体是指采用基因克隆技术将b细胞全套可变区基因克 隆出来，通过与噬菌体衣壳蛋白基因连接，以融合蛋白的形式表达 在噬菌体表面的抗体分子。用b淋巴细胞全套抗体可变区基因克隆 并组装成的噬菌体群体称为噬菌体抗体库1。该技术克服了单 克隆抗体杂交瘤细胞中抗体不稳定、容易丢失的弊端，直接利用抗J中国黠斛网fwww.qikanwang. nel原从抗体库中筛选特异性抗体2-4 。本实验室采用未经免疫的健康斑点叉尾外周血单个核细胞（pbmc ）为基因来源，建立斑点叉尾天然单链（scf V）噬菌体抗体库。构建的主要目的是 为后期筛

8、选抗原特异性抗体打下基础，筛选出的抗体主要用于斑点 叉尾疾病早期的抗体诊断试剂盒，从而更有效地对斑点叉尾疾 病进行防治。1 材料与方法1.1 材料淋巴细胞分离液购自上海超研生物科技有限公司；rna提取纯 化试剂trizol （bioflux）、逆转录试剂盒、taq d na聚合酶、dntp购自takara公司；t4dna连接酶购自promega公司；限制性内切酶spci、xhoi、 saci、xbai、pmd18t simple vecto r载体及试验所用培养基均购自北京盈信阳光生物技术有限公司； dna凝胶回收试剂盒，质粒纯化试剂盒均购自鼎国生物公司。宿主菌xllblue，由本实验室保存；

9、辅助噬菌体vcs m 13，来自武汉生物制品研究所；载体p3mh，由海军总医 院王琰教授惠赠，由本实验室保存。引物序列：p1(vhfor) :5cggagctcacaccagt cctttggggaaatcgtc3J中国黠斛网fwww.qikanwang. nelp2(vhbackSgctctagagactggctctttctgaacgtgaccg 3p3(vlfor) : 5cgagctctctgctct tccaggagaaacagtcac 3p4(vlback) : 5gctctagagacaccaccttgttcctcp5(vhf tgg ggc gga ggc gga ggt ctc

10、 tctcactgac orlinkeggg accggt tcaggc tctcca33 rvlbac gtc acc ggc gga ggc tcgk) :5gtc ggtggt ggcatt gag1.2 试验方法1）淋巴细胞的提取和纯化。通过尾静脉从未经免疫的多条斑点 叉尾抽取外周静脉血共2 5 0 ml,常规方法分离pbmc。 洗涤计数后，每10 7个细胞加1 ml trizo l提取总rn a,经异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤后溶于1g/l depc水中，取适量做琼脂糖凝胶电泳，鉴定rna质量，并用紫外分光光 度计测定rna浓度，其余保存于70J中国黠斛网fwww.qikanwang.

11、 nel2）逆转录cdna和per扩增vh段及vl链基因。以oligodt 20为引物，按照takara产品说明书，将rn a逆转录为cdna。分别用轻链vl,重链vh引物（pl、p 2、p3、p5 ）进行per扩增。95C预变性5 min;94 C 3 0s,64 C （不同引物组合退火温度不同，波动于556 5 C之间）30s,72 C 50s,30 35个循环；72 C延伸10 min。3）以纯化的vh、vl基因为模板，以与vh基因3端和vl基因5端序列互补的p5为引物， 进行重叠延伸反应，4卩l2 0 mmol/l 的mgcl2,5l 10Xmmol/ldntp,0.5 l bsa（1

12、0 mg/ml）,2 l c dna,28.5 l去离子水，总体积50l,反应条件为9 4 C 1 min,63 C 4 min,共7个循环，将 vh、 vl随机拼接为单链（scfv）。4）单链（scfv）pcr产物经过电泳，回收，纯化，连接t载体，然后转化xll blue，提取质粒后，经saci和xbai双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带。将表达载体p3mh用同样的两个酶进行酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，再与已经回收的轻链片断进行连接反应（pcr产物0.45卩g，线性载体1.4g），4 C连接过夜。次日加入200卩l超级感受态xllblue，进行热激转化（冰浴30 min，42

13、 C热激90 s，冰浴12 min）。转化反应结7 C,2 0 0 r/mi n振荡1 h加入10ml soc培养基（含50 mg/1 tet和25mg/1amp）。取部 论文就表专家一 j中国学木期刊网 Pwwvv .q i kanwang .net束后立即加入8 0 0 卩g预热到3 7C的soc培养基，3分菌液铺lb amp琼脂平板，计算库容。5）上述菌液加入soc amp培养液振荡1h后，加入辅助噬菌体vcsm 13约1 012 p fu,混匀后加入5 0 ml sob培养基，继续振荡培养2 h,之后加入kana至70 m g/1,37 C振荡过夜。次日4C,40 0 0 r/mi n

14、离心15 min,得到上清液，加入聚乙二醇80 0 0及nacl使两者的终浓度为40g/1和30g/1。振荡促溶，冰浴30 min,9 0 0 0 r/mi n离心20 min,4 C。弃 上清液，用2 m1 10g/1 bsa pbs悬浮噬菌体沉淀，1 4 0 0 0 r/mi n离心5 min,除去残留的细菌碎 片。收集上清液，加入nan3至0.2g/1,4 C保存。至此，用dna重组的方法，将单链基因（scf v）组合到了噬粒 载体，即为scf v噬菌体表面呈现文库 。6）将适量o va smp、ova smz分别溶解于0.1 mo1/1 p h 9.6的碳酸盐缓冲液中，包被无菌e1is

15、a 板，10 0卩1/孔，置于无菌小湿盒4 C过夜。次日用pbs t洗板3次后用5% bsa pbs 37 C封闭2 h,弃封闭 液，同上洗涤，干燥备用。7）取等体积1% ova pbs与库菌液混合，37C孵育论文发袤专家一 趣|中国学木期刊网 .q i kanwang .net3 0 min。取包被孔2孔，加入上述混合液100/孔，3 7 C孵育2 h;同时接种10 口1大肠杆菌xllbluc于10 ml lb中，37C 2 2 0 r/mi n振荡培养至对数生长期。弃去孔中的液体，用15 0卩1/孔pbst(0.1% tween-2 0)洗涤，过程中用移液器反复吹打，重复洗涤5次，每次5

16、min。然后加入100 卩1孔甘氨酸 盐酸洗脱液(ph 2. 2) , 3 7 C孵育3 0 min,再加入7卩1/孔 2 mol/1tris中和，之后将液体转移到10m1无菌离心管中，加入2ml新鲜制备的大肠杆菌x11b1ue, 37 C孵育 30min,分别取10卩1、1卩1、0.1卩 1涂 lb a t 平板(amp 50 卩 1/ml, tet 10 卩 1/m1),37 C培养过夜，计数菌落数，测定转化率。其余菌液全部 转入10 ml lb培养液(tet 10 g/ml )中，加入5 口1 amp,37C振荡培养1h,再加入5 卩1 amp,继续振荡培养1 h,然后再转入10 0 m

17、l lb培养液(amp 5 0 ag/m1,tet 10 g/ml )中继续培养2h,加入约1 0 12 p fu辅助噬菌体vcsm 13,37 C继 续培养2 h,再加入卡那霉素终浓度至7 0卩g/m l , 3 7 C18 0 r/mi n振荡培养过夜4C,40 0 0 r/min离心15 min,收集上清液，加入4 g peg 8000和3g nac1,37 C摇床促溶5 min后冰浴30 min,4 C 80 0 0 r/mi n离心3 0 min, 弃上清液，倒置画艸国学木期刊网.q i kanwang Pnel离心管10min沥干残液，加入3 ml含1%bsa的tbs重悬沉淀，4

18、C 120 0 0 r/mi n离心5 min,收集上清液即为次级scf v噬菌体抗体库。每一轮筛选后均测定次级库的滴度并计算噬菌体投入/产出比（回收率），作为特异性 噬菌体抗体富集的指标。8）单克隆噬菌体抗体的制备。将获得的单个噬菌体克隆转染新鲜制备的大肠杆菌xllblue，铺 lb平板（amp 50 g/ml,tet 10 g/ml） ,37 C培养过夜。挑取3 0个单菌落，分别接种到2 m l lb培养基中（amp 5 0卩 g/ml,tet 10 g/ml） ,37C振荡培养至对数生长期，加入5 0 al vcsm 13,37 C 振荡培养2 h, 之后加入卡那霉素至终浓度7 0 a

19、g/ml,30 C振荡培养过 夜。4C,1 20 0 0 r/mi n离心10 min,收集上清液即为单抗。9）噬菌体单抗的elisa鉴定。用elisa法进行抗体特 异性结合性能的鉴定：分别用o va smp、ova smz包 被酶标板，3%bsa pbs圭寸闭，之后将上步中单抗用1%b sa pbs稀释1倍加入到酶标板中37C孵育2 h,同时设空白、vcsm13、ova做阴性对照。2 结果2.1 总rna提取由图1可见，甲醛变性电泳显示rna条带清晰，28s、18论文发袤专家一 趣|中国学木期刊网 .q i kanwang .nets亮度之比约为2：1，并且可以见到微弱的5 s条带（图 1）

20、。测定a值1.8，说明rna无降解，无蛋白污染，可以作为模板进行逆转录。2.2 逆转录生成cdnacdna 第一链电泳显示cdna为从25025 0 0 bp弥漫性分布的条带。用设计的18s引物做内参，扩增后可见明显18 s条带，证明cdna性质良好。2.4pcr扩增重链vh段和轻链vl段扩增的重链vh段和轻链vl段产物经过1%琼脂糖凝胶电泳， 在6 5 0 bp左右可见较亮特异性条带。2.5 通过1 inker连接重链vh段和轻链vl段成单链 （scf v）基因连接重链vh段和轻链vl段成单链（scf v）段产物经过1%琼脂糖凝胶电泳，在1400 bp左右可见较亮特异性条带。2.6 单链（s

21、cf v）噬菌体抗体的构建及鉴定切下14 0 0 bp左右条带回收后连接t载体，将k t链、入t链合并与p3mh分别用saci和xbai双酶切，琼脂 糖凝胶电泳可见约1400 bp和4000 bp大小的单一一条带，为所需的载体和目的片段。回收后将二者连接，电转化，摇 论文发表专家一 J中国学木 .q i kanwang Pnet菌扩增，提取质粒dna，用saci和xbai双酶切后电泳，显示出约40 0 0 bp和约14 0 0 bp的两条带，说明单链（scf v）库构建成功。所获得的轻连库的库容为5.1X10 7。对随机挑选的2 0个单菌落进行菌液per，其中18个可以扩增出轻链片段，说明重组

22、率为9 0%。2.7 噬菌体抗体库的构建及鉴定经过提取抗体库质粒dna，分别用xho i和spei,sa ci和xbai双酶切后电泳，显示4100 bp和1 400bp左右条带；用xho i单酶切，显示约55 0 0 bp大片段。以噬菌体抗体库噬粒dna 为模板，以单链（scf v）引物组合 进行per，扩增出约1 4 0 0 bp的插入片段，说明构建抗体 库成功。抗体库进行了 4次构建，按照兰风华等5的方法计算库容分别为 1 .63X107、1.11X107、1.42X1 07、1. 5 1X10 7,积累在一起总库容为5.6 7 X 1 0 7,单链（scf v）库的重组效率达到9 0%。

23、2.8 抗体的筛选分别用o va smp、ova smz为固相抗原对噬菌体抗 体库进行5轮富集筛选。从表1、表2中可以看出，随着筛选轮数 的增多，虽然抗原包被量在不断减少，洗脱次数不断增加，抗体的 投入产出比仍不断升高，说明噬菌体抗体得到明显富集。2.7 噬菌体抗体的elisa检测论文发表专家一 恤|中国学木期刊网 .q i kanwang Pnel挑取单个克隆，小规模制备抗体后，ova-smp、ova s mz作为包被抗原，设空白、vcsml3、ova做阴性对照，对6 0个样进行平行检测，结果得到smp阳性菌株11个，sm z阳性菌株9个，其余均为阴性。3 讨论斑点叉尾是水产养殖中的重要经济

24、鱼种，在其原产地美国的养 殖规模达到水产养殖的6 0%以上。弓I进我国以来，养殖规模日益 扩大，出口量也不断增加。此次试验我们选择斑点叉尾作为建库 对象，不仅是因为它在水产养殖业中的重要地位，还在于它是硬骨 鱼类免疫系统研究较为透彻的模式动物之一。作为硬骨鱼类的代表 性鱼种，斑点叉尾的优势在于，目前已经积累了大量关于斑点 叉尾免疫球蛋白结构和功能方面的生物学信息；已经建立起体 外细胞培养体系，可以利用此体系做抗原递呈，细胞融合及温度对 免疫系统影响方面的试验；已经建立起特定类型的无性白细胞系 包括b细胞、巨噬细胞、t细胞及nk细胞等6。选择未经免疫 的斑点叉尾，分离外周血淋巴细胞，提取总rna

25、，模拟其体内 天然的抗体谱，构建大库容噬菌体抗体文库，为进一步筛选特异性 抗体打下基础。噬菌体抗体库技术诞生以来，已经取得了巨大的成果，显示它的 强大生命力。它不仅能够生产具有识别功能的特异性抗体，而且能 够筛选和生产具有催化和切割功能的抗体酶，解决了杂交瘤系统低 效及鼠单抗的动物源性难题，对于肿瘤、自身免疫性疾病和感染性 论文发表专家一J中国学木期刊夙%ww .q i kanwang ,nei疾病发病机理的研究、诊断、被动免疫和治疗有极为重要的试验价目前认为抗体引物的多样性与细菌转化率是影响抗体库容量的 主要因素，而库容的大小与抗体亲和力大小成正比。为了获得亲和 力高的抗体，本试验从5 0尾

26、健康未经免疫的斑点叉尾外周血中 分离出淋巴细胞抽提总rna，经15对特异性引物rt-pcr 扩增出scf v抗体基因片段，制备超级感受态进行转化，经过四 次转化构建的库容为5.6 7 X 1 0 7。如果要得到接近体内b淋 巴细胞群数量（约10 8）的抗体库，必须通过增加转化次数来累 积库容。据相关文献报道lobb等8通过上百次的电穿孔转化 获得了10 10的抗体库，接近体内经过人工免疫达到的抗体水 平。接近体内经过人工免疫达到的抗体水平。在从自建的斑点叉尾天然单链（scf v）噬菌体抗体库中筛 选得到抗磺胺类药物的鱼源单抗。试验中利用偶联卵血清蛋白的两 种磺胺类药物包被固相，对自建的斑点叉尾天然单链（scfv） 噬菌体抗体库进行筛选，在筛选过程中，抗原浓度呈半数递减，洗 脱次数逐渐增加，以减少亲和力弱的抗体的结合。经过5轮的富集 淘选，我们得到多株特异性良好的抗体，并证明了所构建的噬菌体 抗体库具有良好的多样性。噬菌体抗体库技术的引入使针对性鱼源 单抗的制备成为可能，也为elisa试剂盒研制所需抗体的制备 提供了一种新的方法。参考文献:A医一论文发袤专家一J中国黠斛网fwww.qikanwang. nel1 hoogenboom h r,