一菌种与种子扩大培养

1、第一章第一章 菌种与种子扩大培养菌种与种子扩大培养 重点重点：微生物工业对菌种的要求；生产用菌：微生物工业对菌种的要求；生产用菌 种的保藏及选育；防止菌种衰退的措施种的保藏及选育；防止菌种衰退的措施 难点难点：工业微生物的培养类型：工业微生物的培养类型 第一节第一节 微生物工业用菌种微生物工业用菌种一、微生物工业对菌种的要求一、微生物工业对菌种的要求 培养基原料来源广、廉价； 培养条件易控制； 对于微生物的生长往往存在一个“临界溶临界溶氧浓度氧浓度”，低于这个溶氧浓度，氧就成了微生物生长的限制性因子。 ph值:中性偏酸性，偏碱性，强烈的ph值易改变产物和底物的状态。 温度：最低、最高、最适生长

2、温度，低温菌，耐高温菌种。 渗透压：等渗 发酵周期短； 菌株高产；对于胞外产品，细胞膜具有良好的渗透性，或者细胞膜的渗透性可以调节，细胞不易发生菌体自溶。 对于胞内产品，要求菌体易分离和收集，菌体易破碎； 对于基因工程菌，通常目的产物存在于包含体内，对于包含体，要求在细胞破碎时不易破碎，而在目的产物的分离提取时，则易破碎。 抗病毒（噬菌体）能力强； 菌株性状稳定，不易变异退化； 菌体本身不能是病原菌；二、工业常用的微生物二、工业常用的微生物从微生物分类学的角度，分为：l细菌类： l 短杆菌：氨基酸发酵（谷氨酸）l 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（bf7658）、碱性蛋白 l 酶等l 地衣芽孢杆菌：耐高温

3、-淀粉酶)l 苏云金芽孢杆菌：bt生物农药l 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁酸等发酵l酵母菌： l 啤酒酵母：酿酒酵母、辅酶类物质的发酵l 酒精酵母：酒精l 汉逊酵母：食品工业，用于乙酸乙酯的发酵l 假丝酵母：scp生产，石油发酵l霉菌： l 黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、l 酶制剂工业（糖化酶）l 黄曲霉：酱油生产(3042)，面酱l 青霉菌：青霉素的生产l 红曲霉：红曲制造，用于南方红曲酒l （女儿红）的生产；使用红色色 l 素的生产；豆腐乳的生产等l 赤霉菌：赤霉素的生产，是一种植物生l 长激素属 名种 名用 途假单孢菌属铜绿假单孢菌谷氨酸、水杨酸、丙酮酸、蛋白酶短小假单孢菌赖氨酸萤光假单孢菌天冬

4、氨酸、葡糖酸、2-酮基葡糖酸、甲烷假单孢菌甲烷、丙烷粘性糖类麦氏假单孢菌2-酮古洛糖酸卵假单孢菌葡糖酸、天冬氨酸臭味假单孢菌瓜氨酸醋杆菌属纹膜醋杆菌醋酸、丙酸、丁酸、葡糖酸、山梨醇黑色醋杆菌2，5-二酮基葡糖酸奥尔兰醋杆菌啤酒、醋酸氧化醋杆菌酒类巴氏醋杆菌醋酸、山梨糖恶臭醋杆菌醋、山梨糖、二羟基丙酮弱氧化醋杆菌5-酮基葡糖酸、丙酮酸、山梨糖拟胶醋杆菌丙酮酸、山梨糖、纤维素属 名诺卡氏菌属拟无枝酸菌属分枝杆菌属种 名珊瑚色诺卡氏菌小球诺卡氏菌鼠白诺卡氏菌暗色诺卡氏菌石蜡诺卡氏菌嗜石油诺卡氏菌东方诺卡氏菌地中海拟无枝酸菌黄色分枝杆菌甲烷分枝扦菌石蜡分枝杆菌耻垢分技杆菌用 途正烷烃2，2-二甲基粘康

5、酸正烷烃谷氨酸利福霉素单细胞蛋白正丁烷葡萄糖、糖醛酸单细胞蛋白万古霉素利福霉素石油发酵属 名种 名用 途毛霉属卷枝毛雹脂肪爪哇毛霉蛋白酶、果胶酶、甾族化合物转化东北毛霉丙酮酸高大毛霉草酸、丁二酸、脂肪、甾族化合物转化微小毛霉丙氨酸、凝乳酶、蛋白酶、甾族化合物转化总状毛霉丙氨酸、蛋白酶、3-羟基丁酮、甾族化合物转化淀粉酶、蛋白酶、丙二酸、乳酸、丙酮酸三、生产菌种的保藏与选育三、生产菌种的保藏与选育 菌种保藏 （1）目的： 存活，不丢失，不污染； 防止优良性状丢失； 随时为生产、科研提供优良菌种。 （2）基本原理：根据菌种的生理生化特点，人工地创造 条件，使菌种的代谢活动处于不活泼状态。 （3）常

6、用的菌种保藏方法： 斜面低温保藏法、甘油低温保藏法、砂土保藏法、麸皮保藏法、冷冻干燥法、液氮超低温冻结法等。几种常用菌种保藏方法的比较方法名称主要措施适宜菌种保藏期评价冰箱保藏法（斜面）液氮超低温保藏法甘油低温封藏法沙土保藏法冷冻干燥法低温超低温低温、缺氧干燥、无营养干燥、无氧、低温、有保护剂各大类各类各大类产孢子微生物各大类36月长期1年以上110年515年以上简便液氮简便简便有效设备划线培养后的细菌菌落酿酒酵母霉菌孢子l国内外菌种保藏机构：国内外菌种保藏机构： 菌种保藏机构的任务：菌种保藏机构的任务：广泛收集科研和生产菌种、广泛收集科研和生产菌种、 菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰

7、、菌株，并加以妥善保管，使之达到不死、不衰、 不乱以及便于研究、交换和使用的目的。不乱以及便于研究、交换和使用的目的。 菌种保藏机构：菌种保藏机构： 中国微生物菌种保藏委员会中国微生物菌种保藏委员会(ccccm) (ccccm) 美国的典型菌种保藏中心美国的典型菌种保藏中心(atcc)(atcc) 英国国家典型菌种保藏所（英国国家典型菌种保藏所（nctcnctc） 法国里昂巴斯德研究所（法国里昂巴斯德研究所（iplipl） 工业微生物工业微生物 // 农业微生物农业微生物 http:/ （1）目的：

8、改善菌种的特性，使提高产量，改进质量，降低成本，改革工艺，方便管理及综合利用等。 （2）方法：a、自然选育；b、抗噬菌体菌株选育；c、诱变育种；d、代谢控制育种；e、基因重组育种；五、防止菌株衰退的措施 1、菌种退化：多次传代，发酵力、繁殖力下降；发酵产物得率低。 2、衰退的可能原因 菌种保藏不妥； 培养要求未得到满足； 3.3.防止菌种衰退的方法防止菌种衰退的方法 尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素尽可能满足其营养条件、培养条件，避免有害因素 影响；影响； 尽量减少传代次数；尽量减少传代次数； 采用幼龄菌种；采用幼龄菌种； 4.4.菌种复壮方法菌种复壮方法 分离复壮（稀释平板法、平

9、板划线法等）；分离复壮（稀释平板法、平板划线法等）； 若单菌落分离不行，可改变培养条件，或两者结合若单菌落分离不行，可改变培养条件，或两者结合进行复壮；进行复壮； 诱变因素处理，再进行单菌落分离；诱变因素处理，再进行单菌落分离；第二节第二节 种子扩大培养种子扩大培养一、种子扩大培养的任务一、种子扩大培养的任务 1.任务：每次发酵罐的投料，要提供相当数量代谢旺盛的种子。根据菌种生长速度快慢来决定扩大培养的级数；2、三级发酵（50吨发酵罐）： 斜面一级摇床二级种子罐三级种子罐发酵罐二、工业微生物的培养类型二、工业微生物的培养类型 静置培养法（厌气性发酵）；少，如酒精发酵 通气培养法（好气性发酵）；

10、主要，如抗生素等l通气培养法作为种子扩大培养的具体方法： 液体培养法：三角瓶摇床震荡或回转式培养； 表面法培养：液体表层，菌体生长于表面； 固态法培养：固体培养基表面生长固态法培养：固体培养基表面生长l大规模工业生产的培养方法及特点：大规模工业生产的培养方法及特点： 固体培养（曲法培养）固体培养（曲法培养） 浅盘固体培养浅盘固体培养 深层固体培养深层固体培养 特点：酶活力高，但劳动强度大，曲层需翻动。特点：酶活力高，但劳动强度大，曲层需翻动。 液体培养液体培养 浅盘液体培养：已不用，占地面积大浅盘液体培养：已不用，占地面积大 液体深层培养：几乎所有的好气培养都采用液体深层培养：几乎所有的好气培

11、养都采用 特点：培养条件易控制，如温度，特点：培养条件易控制，如温度，phph等，但易染菌，等，但易染菌，要求无菌。要求无菌。载体培养：载体培养： 吸收了固态的曲法培养与液态培吸收了固态的曲法培养与液态培 养的优点，是近年新发展的一种培养方法。养的优点，是近年新发展的一种培养方法。特点：固态基质做载体，发酵结束后将培养基及特点：固态基质做载体，发酵结束后将培养基及菌体挤压出来，载体可反复使用，如脲烷泡沫菌体挤压出来，载体可反复使用，如脲烷泡沫塑料块。塑料块。两步法液体深层培养：在酶制剂和氨基酸生产两步法液体深层培养：在酶制剂和氨基酸生产中应用较多。中应用较多。 特点：控制菌体生长条件与产酶条件

12、区分开来，特点：控制菌体生长条件与产酶条件区分开来，如先菌体生长，再改变条件产酶。如先菌体生长，再改变条件产酶。三、影响种子质量的主要因素三、影响种子质量的主要因素 1.培养基 主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。 选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。l 对于种子用的培养基，摇瓶与种子罐用的培养基不相同，摇瓶要求培养基用的原材料精细，碳源浓度较低而且是用微生物较易利用的碳源；对于种子罐用培养基，要求使用接近大生产用的原材料，氮源浓度较高，有利于菌体的增殖。例如：hass（高温淀粉酶）l 三角瓶用碳源：葡萄糖+乳糖l 3m3种子罐：液化淀粉2、种龄与接种量：l种龄以对数期为宜

13、；种龄以对数期为宜；l接种量宜适当大；接种量宜适当大；l接种量大的优缺点：接种量大的优缺点： 优点：缩短发酵周期；优点：缩短发酵周期； 减少染菌机会；减少染菌机会； 提高设备利用率提高设备利用率 缺点：种子培养费时；缺点：种子培养费时； 增加级数；增加级数； 代谢废物多代谢废物多3. .培养条件培养条件 温度：温度直接影响生长和酶的合成；温度：温度直接影响生长和酶的合成； 种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种种子扩大培养的温度，从试管到三角瓶到种子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的子罐，其温度也应逐步调整，最后接近大生产的温度，目的在于使菌种逐渐适应。温度，目的在于使菌种逐渐适应。 许

14、多微生物其最适生长温度与最适发酵温度许多微生物其最适生长温度与最适发酵温度往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生往往有差异的，例如：谷氨酸发酵，谷氨酸产生菌的最适合生长温度为：菌的最适合生长温度为：3030，而产物合成温度，而产物合成温度为为32-3432-34 phph值：对微生物有明显的影响。值：对微生物有明显的影响。l 1 1）扩培选择的）扩培选择的phph值是菌体的最适生长值是菌体的最适生长phph值。值。l 2 2）培养基灭菌后，通常其）培养基灭菌后，通常其phph值要下降值要下降1.0个单位个单位 l通气搅拌：（溶解氧的作用：参与菌体呼吸通气搅拌：（溶解氧的作

15、用：参与菌体呼吸 作用）菌种扩大培养的目的就是提供大量的强作用）菌种扩大培养的目的就是提供大量的强壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度壮的菌体，因此在扩培过程要求菌体增殖速度越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，越快越好，增殖期消耗的底物葡萄糖越少越好，从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧从这个意义上讲，扩培过程中应提供足够的氧气。气。l 足够的溶氧取决于：搅拌转速、通气量、足够的溶氧取决于：搅拌转速、通气量、搅拌功率等搅拌功率等 泡沫泡沫( (危害：影响微生物对氧的吸收；妨碍危害：影响微生物对氧的吸收；妨碍co2co2的排除；减少设备利用率的排除；减少设备利用率) ) 消泡方法：

16、化学法（为主）、机械法消泡方法：化学法（为主）、机械法l常用消泡剂：植物油，矿物油等常用消泡剂：植物油，矿物油等 3 3. .染菌的控制染菌的控制 染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构染菌原因：设备、管道、阀门漏损、发酵罐结构“死角死角”、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严、灭菌不彻底、空气净化不好、无菌操作不严、菌种不纯；菌种不纯； 4.4.种子罐级数：级数少则简单种子罐级数：级数少则简单 l种子罐级数的选择取决于：种子罐级数的选择取决于： 种子的性质（生长繁殖性能）；种子的性质（生长繁殖性能）； 孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）；孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）； 孢子发芽及菌丝繁殖速度；孢子发芽及菌丝繁殖速度； 发酵罐中种子的最低接种量（一般发酵罐中种子的最低接种量（一般10%10%）；）； 种子罐与发酵罐的容积比；种子罐与发酵罐的容积比； 1 1、能源