牙周病分子生物学

1、牙周病分子生物学牙周病分子生物学molecular biology of periodontal diseases李李 德德 懿懿上海第二医科大学附属第九人民医院上海第二医科大学附属第九人民医院一、概述一、概述二、牙周病的分子致病二、牙周病的分子致病1.1.微生物的毒力因子微生物的毒力因子2.2.宿主因子宿主因子三、核酸杂交法检测牙周病有关细菌三、核酸杂交法检测牙周病有关细菌定义（定义（definition） 分子生物学技术研究与牙周病密切分子生物学技术研究与牙周病密切相关生物大分子（蛋白、核酸）的一门相关生物大分子（蛋白、核酸）的一门新兴学科新兴学科前瞻性、交叉性。前瞻性、交叉性。研究内容研

2、究内容4宿主基因水平或分子水平阐明牙周病发病机制和流宿主基因水平或分子水平阐明牙周病发病机制和流行规律行规律4牙周病原菌的蛋白和核酸牙周病原菌的蛋白和核酸(dna、rna)分子结构分子结构追踪病原菌传播途径、发现病原体变异。追踪病原菌传播途径、发现病原体变异。4牙周病的发生发展规律与微观的病原菌或宿主基因牙周病的发生发展规律与微观的病原菌或宿主基因特征联系起来特征联系起来牙周病临床的分子诊断、分子指征、牙周病临床的分子诊断、分子指征、分子预后乃至基因治疗分子预后乃至基因治疗牙周病的分子致病牙周病的分子致病molecular pathogenesis of periodontal disease

3、微生物的毒力因子微生物的毒力因子 研究牙周病原菌的蛋白和核酸分子研究牙周病原菌的蛋白和核酸分子结构，评价毒力因子的作用。结构，评价毒力因子的作用。宿主因子宿主因子 研究细胞因子和遗传因子的作用。研究细胞因子和遗传因子的作用。微生物的毒力因子微生物的毒力因子microbial viralence factors内毒素内毒素(lipopolysaccharide, lps) g-菌胞壁外膜的脂多糖成分菌胞壁外膜的脂多糖成分（磷脂多糖蛋白质）。（磷脂多糖蛋白质）。 十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳十二烷基磺酸钠聚丙烯凝胶电泳 page-sds gel 银染色银染色silver stain 内毒素免疫印迹

4、内毒素免疫印迹lps-immuno-blotting牙龈素牙龈素(gingipains)最初称为胰酶样蛋白酶最初称为胰酶样蛋白酶(trypsin-like protease, tlp),又称卟啉素又称卟啉素(porphypains)存在于存在于pg的外膜、膜泡或胞外的一组蛋白酶的外膜、膜泡或胞外的一组蛋白酶超速离心超速离心(10000g20min,4)提取胞外膜提取胞外膜泡泡高凝胶液相色谱法高凝胶液相色谱法(gf-hplc)分离纯分离纯化。化。精氨酸牙龈素精氨酸牙龈素(arginine-gingipains, rgps):特异性切断蛋白质与精氨酸残基结合的肽段，由特异性切断蛋白质与精氨酸残基结

5、合的肽段，由rgpa(前肽区、蛋白酶区、粘附区前肽区、蛋白酶区、粘附区)和和rgpb(无粘无粘附区附区)二个基因编码二个基因编码赖氨酸牙龈素赖氨酸牙龈素(lysine-gingipain, kgp):特异性切断蛋白质与赖氨酸残基结合的肽段，由特异性切断蛋白质与赖氨酸残基结合的肽段，由kgp(前肽区、蛋白酶区、粘附区前肽区、蛋白酶区、粘附区)单个基因编码单个基因编码pg同源突变株的性状改变同源突变株的性状改变 突变株突变株性状改变性状改变rgpa粘附能力部分丧失粘附能力部分丧失降解降解i型胶原能力丧失型胶原能力丧失rgpa、rgpb抑制中性粒细胞功能丧失抑制中性粒细胞功能丧失菌毛缺失菌毛缺失kg

6、p菌落无法变黑菌落无法变黑(影响利用血红蛋白影响利用血红蛋白)rgpa、rgpb、kgp胞外蛋白水解活性丧失胞外蛋白水解活性丧失牙龈素功能牙龈素功能有助于粘附定植：对纤维蛋白的亲和力。有助于粘附定植：对纤维蛋白的亲和力。毒性作用：破坏宿主组织细胞的活性成分毒性作用：破坏宿主组织细胞的活性成分(蛋白、多肽蛋白、多肽)、降解胶原；促进缓激肽释放，提高血管通渗性，增加降解胶原；促进缓激肽释放，提高血管通渗性，增加龈沟液量，组织水肿。龈沟液量，组织水肿。帮助细胞生长：将组织蛋白质降解为短肽链，扩大细帮助细胞生长：将组织蛋白质降解为短肽链，扩大细菌营养摄取范围，为细菌生长和毒力发挥提供养分。菌营养摄取范

7、围，为细菌生长和毒力发挥提供养分。干扰宿主免疫反应：影响中性白细胞功能，降解宿主干扰宿主免疫反应：影响中性白细胞功能，降解宿主细胞的细胞的lps受体受体cd14，降解细胞因子，降解细胞因子il-1、il-6、il-8及及tnf等。等。菌毛亚单位蛋白结构基因菌毛亚单位蛋白结构基因(fim a) 粘附有关的毒力因子粘附有关的毒力因子 纤毛素纤毛素(fimbrilin) 粘附素粘附素(adhesin) 血细胞凝集素血细胞凝集素(hemagglutinin) 1988年年dickinson等首先获得含编码等首先获得含编码pg纤毛素基因的克隆质粒纤毛素基因的克隆质粒puc 13bg12.1，该基，该基因

8、为染色体上的单拷贝基因，它的氨基酸序列因为染色体上的单拷贝基因，它的氨基酸序列与其他菌毛无同源性，可利用该特异基因作探与其他菌毛无同源性，可利用该特异基因作探针鉴定针鉴定pg，可进一步研究，可进一步研究pg菌毛的致病作用。菌毛的致病作用。胶原酶基因胶原酶基因(prtc) pg的胶原酶能降解的胶原酶能降解i型胶原，破坏牙型胶原，破坏牙周组织附着。周组织附着。 已测知表达胶原酶活性的已测知表达胶原酶活性的prtc基因基因序列，它存在于序列，它存在于pg的三种主要血清型中，的三种主要血清型中，编码编码1个个37501.38蛋白质。蛋白质。白细胞毒素基因白细胞毒素基因(lkt a、b、c、d) aa是

9、口腔中唯一能产生白细胞毒素是口腔中唯一能产生白细胞毒素(leukotoxin,lkt)的细菌，白细胞毒素仅能的细菌，白细胞毒素仅能杀死人或灵长类的多形核白细胞、单核细胞杀死人或灵长类的多形核白细胞、单核细胞和巨噬细胞，抑制破坏宿主的免疫防御机制。和巨噬细胞，抑制破坏宿主的免疫防御机制。 现已克隆和测知现已克隆和测知lkt a的序列，且在受体的序列，且在受体菌中得到表达。编码毒素结构，激活白细胞菌中得到表达。编码毒素结构，激活白细胞毒素。毒素。宿主因子宿主因子host factors细胞因子细胞因子(cytokines) 细胞生物学细胞生物学 细胞因子细胞因子cytokine(ck)免疫学免疫学

10、淋巴因子淋巴因子lymphokine interleukincytikine(li)血液学血液学集落刺激因子集落刺激因子colony stimulation factor(csf)分子生物学分子生物学生长因子生长因子growth factors(gfs) 活化的活化的免疫细胞免疫细胞和某些和某些基质细胞基质细胞分泌的微量分泌的微量生物活性物质。生物活性物质。 本质是本质是蛋白质蛋白质或或多肽多肽。 在体内发挥广泛的在体内发挥广泛的生物学作用生物学作用，与生长、分，与生长、分化、免疫、肿瘤、造血和创伤愈合等多种生化、免疫、肿瘤、造血和创伤愈合等多种生理、病理状态有关。理、病理状态有关。 正常情况

11、下发挥广泛正常情况下发挥广泛生理功能生理功能，一旦失调异，一旦失调异常分泌，又与常分泌，又与疾病相关疾病相关。 目前发现的细胞因子有目前发现的细胞因子有10余族，每余族，每族又有若干亚族，共族又有若干亚族，共100多种，功能大多种，功能大多已阐明，部分已克隆成功，其基因定多已阐明，部分已克隆成功，其基因定位、结构与受体结合机制等均有大量研位、结构与受体结合机制等均有大量研究。究。6 白介素白介素(1-18型糖蛋白型糖蛋白)(interleukin, il)6 肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子(tumor nocrosis factor, tnf)6 粘附分子粘附分子(adhesion molecule

12、, am)6 干扰素干扰素(interferan, ifn)6 转化生长因子转化生长因子-(transforming growth factor- , tgf- )6 成纤维细胞生长因子成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factors, fgfs)细胞因子作用特点细胞因子作用特点4特异性特异性(自分泌、旁分泌作用自分泌、旁分泌作用)对靶细胞存在不同程度特异性。对靶细胞存在不同程度特异性。4多样性、多功能性多样性、多功能性对不同靶细胞、不同浓度或不同生理状态靶对不同靶细胞、不同浓度或不同生理状态靶细胞可有不同作用。细胞可有不同作用。4整体性整体性对细胞、组织的调控不是仅靠对

13、细胞、组织的调控不是仅靠1种，而是种，而是多因多因子参与子参与及及多步骤反应多步骤反应，由几种因子协同或拮由几种因子协同或拮抗配合形成网络抗配合形成网络(network)发挥作用。发挥作用。遗传因子遗传因子(genetic factors) 基因水平阐明牙周病发生、发基因水平阐明牙周病发生、发展和流行规律。展和流行规律。 细菌是引发牙周炎必不可少的因素，但不细菌是引发牙周炎必不可少的因素，但不是唯一因素，宿主也起重要作用。是唯一因素，宿主也起重要作用。 单纯遗传能为患严重牙周炎提供单纯遗传能为患严重牙周炎提供50%以上以上危险性，如：危险性，如： 白细胞减少症白细胞减少症 白细胞粘附缺陷病白细

14、胞粘附缺陷病 down综合征综合征 掌跖角化牙周破坏综合征掌跖角化牙周破坏综合征牙周病的基因研究牙周病的基因研究6号染色体号染色体组织相容性位点变异组织相容性位点变异产生产生igg2能力降低，能力降低， igg2是保护性的，能调理识别是保护性的，能调理识别细菌，以利吞噬杀死。细菌，以利吞噬杀死。染色体染色体1q h131残基多态性残基多态性组氨酸组氨酸纯合子纯合子 吞噬细胞识别吞噬细胞识别igg2的的hfcrra 受体亲和力受体亲和力高高(igg包裹的致病包裹的致病 菌易被吞噬清除菌易被吞噬清除)精氨酸精氨酸纯合子纯合子 受体亲和力低受体亲和力低组组/精氨酸精氨酸杂合子杂合子 亲和力居中亲和力

15、居中 染色体染色体2q 13的的il-1基因基因多态性多态性产生的产生的il-1约为该基因阴性的约为该基因阴性的4倍，倍，40岁后患重度牙周炎的可能性是阴性个体岁后患重度牙周炎的可能性是阴性个体的的20倍倍6号染色体号染色体tnf-基因基因多态性多态性产生大量产生大量tnf-，增强对感染的反应性，增强对感染的反应性核酸杂交法核酸杂交法(molecular hybridization)检测牙周病相关细菌检测牙周病相关细菌概概 述述细菌分类学四个水平细菌分类学四个水平w 细菌形态和行为水平：显微结构、运动性、细菌形态和行为水平：显微结构、运动性、酶、生化及营养需要等酶、生化及营养需要等w 细菌组分

16、水平：胞壁组分、脂类、细胞色细菌组分水平：胞壁组分、脂类、细胞色素及噬菌体系分析素及噬菌体系分析w 蛋白质水平：氨基酸系列、可溶性蛋白凝蛋白质水平：氨基酸系列、可溶性蛋白凝胶电泳及血清学胶电泳及血清学w 基因水平：基因水平：gc mol%，dna-dna杂交，杂交，质粒及遗传物质的转导质粒及遗传物质的转导牙周病有关的特殊细菌牙周病有关的特殊细菌证据充分的致病菌中等证据的致病菌伴放线放线杆菌伴放线放线杆菌aa直肠弯曲菌直肠弯曲菌(actinobacillus actinomycetemcomitans)(campylobacter rectus)牙龈卟啉单胞菌牙龈卟啉单胞菌pg缠结优杆菌缠结优杆

17、菌(porphyromonas gingivalis)(eubacterium nodatum)福塞似杆菌福塞似杆菌bf具核梭杆菌具核梭杆菌fn (bacteroides forsythus)(fusobacteruim nucleatum)中间普氏菌中间普氏菌pi(prevotella intermedia)微小消化链球菌微小消化链球菌pm (peptostreptocoscus micros)中间链球菌群中间链球菌群(intermedius streptococci)牙密螺旋体牙密螺旋体td(treponema denticola)常规方法不能鉴定牙周大量标本细菌的原因：常规方法不能鉴定牙

18、周大量标本细菌的原因：x大多为厌氧菌大多为厌氧菌x培养条件要求高培养条件要求高x鉴定繁杂鉴定繁杂x每牙周袋至少取每牙周袋至少取2个区样本个区样本x每样本至少分离每样本至少分离10株以上可疑菌株以上可疑菌原理原理 所有生物体都以所有生物体都以dna形式通过形式通过4种碱基顺序种碱基顺序来贮存遗传信息，同种生物含相同的来贮存遗传信息，同种生物含相同的dna序列，序列，生物种差别越大，生物种差别越大，dna碱基顺序差别越大。碱基顺序差别越大。 鸟嘌呤鸟嘌呤 腺嘌呤腺嘌呤 胞嘧啶胞嘧啶 胸腺嘧啶胸腺嘧啶g a c t c t 示踪剂标记的特定碱基序列的核酸片段，能示踪剂标记的特定碱基序列的核酸片段，能

19、和互补碱基配对、特异地结合。和互补碱基配对、特异地结合。w 4种核苷酸组成种核苷酸组成dnaw 2条互补链绕成双螺旋结构条互补链绕成双螺旋结构(氢键氢键)严格严格配对规律牢固结合，使配对规律牢固结合，使dna具遗传信息具遗传信息贮存库功能（恒定性、专一性）贮存库功能（恒定性、专一性）w dna上相邻上相邻3个核苷酸编排个核苷酸编排1个密码子，个密码子，决定决定1个特定氨基酸个特定氨基酸w dna核苷酸顺序决定蛋白质的氨基酸顺核苷酸顺序决定蛋白质的氨基酸顺序决定细胞结构和功能序决定细胞结构和功能核酸探针核酸探针(probe)定义定义 能与特定核酸序列发生特异性互补的能与特定核酸序列发生特异性互补

20、的已知核酸片段，用于检测待测样品中是否存已知核酸片段，用于检测待测样品中是否存在与探针相同或相近的在与探针相同或相近的dna序列。序列。 牙周病相关菌的核酸探针是牙周病相关菌牙周病相关菌的核酸探针是牙周病相关菌染色体染色体dna上的有种属特异性的一小段上的有种属特异性的一小段dna（或（或rna）分子的碱基序列，为带标记的单股）分子的碱基序列，为带标记的单股核苷酸，能以互补方式与相应核苷酸，能以互补方式与相应dna键结合。用键结合。用已知细菌的已知细菌的dna探针去探测未知细菌的探针去探测未知细菌的dna，若能杂交形成若能杂交形成dna双链则认为该菌为与探针相双链则认为该菌为与探针相同的菌。同

21、的菌。 放射性同位素标记：如放射性同位素标记：如 32p、35s、3h灵敏度高灵敏度高理化影响小理化影响小污染环境污染环境 使用某些半抗原：如使用某些半抗原：如 生物素、地高辛、荧光素生物素、地高辛、荧光素特异性较低特异性较低敏感性较低敏感性较低 合成小段单链合成小段单链dna方法日臻完善方法日臻完善寡核苷酸的化学合成可由高度自动化寡核苷酸的化学合成可由高度自动化的仪器完成的仪器完成 核酸杂交技术得到发展核酸杂交技术得到发展探针类型探针类型w全基因探针：属内代表菌株分离出全基因探针：属内代表菌株分离出dna并进行标记，制并进行标记，制备简便，特异性较差，有时可与相近属菌种发生杂交备简便，特异性

22、较差，有时可与相近属菌种发生杂交w克隆克隆dna片段探针片段探针随意探针：代表菌随意探针：代表菌dna用限制性内切酶酶切，随意克隆用限制性内切酶酶切，随意克隆一些片段，找到仅能与本属内菌株杂交的一些片段，找到仅能与本属内菌株杂交的dna片段片段特异性高，但需大量试验方能验证其特异性特异性高，但需大量试验方能验证其特异性w特定探针：克隆属内代表菌特异性蛋白或毒力因子的基特定探针：克隆属内代表菌特异性蛋白或毒力因子的基因，从该基因中取一段作为探针，检验致病菌具独特作因，从该基因中取一段作为探针，检验致病菌具独特作用，但需对其特异性、敏感性验证用，但需对其特异性、敏感性验证探针的验证探针的验证w 特

23、异性验证：特异性验证：必须与必须与50种菌属的种菌属的80300株菌株进行杂交株菌株进行杂交必须与相近细菌属中的大量菌间排除必须与相近细菌属中的大量菌间排除“交叉杂交交叉杂交”如伴放线放线杆菌嗜血杆菌属菌株如伴放线放线杆菌嗜血杆菌属菌株w 敏感性验证：敏感性验证：必须与同属各地区分离的必须与同属各地区分离的100株以上菌种进行杂株以上菌种进行杂交交如核酸杂交结果与生化反应鉴定结果有出入，应如核酸杂交结果与生化反应鉴定结果有出入，应进一步验证生化结果。进一步验证生化结果。寡核苷酸寡核苷酸(oligonucleotide)探针序列探针序列细菌 探针名称 序列aaaa-2cttcgggcacyagg

24、gctaaaccccpgpg-1caatactcgtatcgcccgttattcpg-3ctgtggaatcttgacggtatatcgpg-4gtataaaagaagtttaaayccttpg-5ccgatgcttattcttacggtacatpg-6ccttaggacagtcttccttcacgcbfbf-2cgtatctcattttattcccctgtabf-4ctgtagagcttacactatatcgcapipi-1ggtccttattcgaagggtaaatgcpi-2ccctaggygcgctcctcgcggtta特定特定dna片段探针序列（基因探针）片段探针序列（基因探针）细菌

25、 靶基因 序列 长度aalkta5-cagcaagctgcacagtttgcaaa-3238bp5-cattagttaatgccgggccgtct-316sr dna5-gctaataccgcgtagagtcgg-3443bp5-atttcaccctcacttaaaggt-3 16sr dna 5-ctcagagatggtttgtgcc-3273bp5-agattcactccccatcgctg-3pg fim a5-ataatggagaacagcaggaa-3131bp5-tcttgccaaccagttccattgc-3prt c5-acaatccacgagaccatc-3584bp5-ttc

26、agccacaccgagacg-316sr dna5-aggcagcttgccatactgcg-3404bp5-actgttagcaactaccgatgt-3续表细菌 靶基因 序列 长度pg16sr rna5-gcgtatgcaacttgccttac-3518bp5-gtttcaacggcaggctgaac-3fn50475-caaatgcttgtgtcaataatact-30.5kb5-tttagaagaaatggtagaataat-3505905-attgtggctaaaattastagtt-31kb5-accctcactttgaggattatag-3pi 18sr rna5-cctaat

27、acccgatgtccaca-3855bp5-aaggagtcaacatctctgtatcc-3tdtdpa5-aaggcggtagagccgctca-3311bp5-agccgctgtcgaaaagcca-3pcr扩增扩增16srrna 基因病原菌检测遗基因病原菌检测遗传学分类传学分类 rrna是细胞中最多的一种是细胞中最多的一种rha，很多分，很多分子组成核蛋白体子组成核蛋白体(核糖体核糖体)，rrna分子大小一般分子大小一般用超速离心的沉降系数用超速离心的沉降系数s表示，表示，s越大，分子越大，分子也越大。也越大。 16srrna基因：细菌染色体上编码基因：细菌染色体上编码rrna相对应

28、的相对应的dna序列序列4保守区稳定性（细菌共有，称保守区稳定性（细菌共有，称“分子化分子化石石”）4可变区特异性（保守区间有可变区特异性（保守区间有v1v10可变可变区，含种属差异信息，如出现区，含种属差异信息，如出现3个碱基以上个碱基以上差异，便可判定不同属）差异，便可判定不同属）4多拷贝敏感性（约多拷贝敏感性（约1500个核苷酸，每细菌个核苷酸，每细菌含含510个拷贝）个拷贝） 16srrna编码基因编码基因4保守区的引物：对所有细菌均适宜的引物保守区的引物：对所有细菌均适宜的引物4可变区的引物：可变区的引物：pcr扩增，凝胶电泳可鉴扩增，凝胶电泳可鉴别细菌种属别细菌种属4间隔区的引物：间隔区的引物：16srrna和和23srrna编码编码基因间存在基因间存在0.5kb间隔区，不同种属间隔区间隔区，不同种属间隔区长度的序列有特