免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation).doc

1、免疫共沉淀（ Co-Immunoprecipitation ）一原理：免疫共沉淀（ Co-Immunoprecipitation ）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质 X 的抗体免疫沉淀 X ，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y 也能沉淀下来。目前多用精制的 prorein A 预先结合固化在 argarose的 beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads 上的 prorein

2、A 就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。其优点为：（ 1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（ 2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响； （ 3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为： （1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质蛋白质相互作用；（ 2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（ 3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。二、准备工作：预冷 PBS， RI

3、PA Buffer ，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机1.用预冷的 PBS 洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS；2.加入预冷的 RIPA Buffer(1ml/107个细胞、 10cm 培养皿或150cm2 培养瓶， 0.5ml/5106个细胞、 6cm 培养皿、75cm2 培养瓶 )3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到 1.5EP 管中， 4，缓慢晃动15min （ EP 管插冰上，置水平摇床上）4. 4， 14000g 离心 15min ，立即将上清转移到一个新的离心管中5. 准备 Protein A agarose，用 PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配

4、制成 50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠6. 每 1ml 总蛋白中加入100l Protein A琼脂糖珠（50%）， 4摇晃 10min （ EP 管插冰上，置水平摇床上），以去除非特异性杂蛋白，降低背景7. 4， 14000g 离心 15min ，将上清转移到一个新的离心管中，去除 Protein A 珠子8. (Bradford 法 )做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度，测前将总蛋白至少稀释 1：10 倍以上，以减少细胞裂解液中去垢剂的影响（定量，分装后，可以在 -20保存一个月）9. 用 PBS 将总蛋白稀释到约 1 g/l ，以降低裂解液中去垢剂的浓度，如

5、果兴趣蛋白在细胞中含量较低，则总蛋白浓度应该稍高（如10 g/l ）10. 加入一定体积的兔抗到 500l 总蛋白中， 抗体的稀释比例因兴趣蛋白在不同细胞系中的多少而异11. 4缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建议用2 h 室温孵育12. 加入 100l Protein A 琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物， 4缓慢摇动抗原抗体混合物过夜或室温 1h，如果所用抗体为鼠抗或鸡抗，建议加 2 l 过渡抗体 （兔抗鼠IgG ，兔抗鸡 IgG ）13. 14000rpm 瞬时离心 5s，收集琼脂糖珠 -抗原抗体复合物，去上清， 用预冷的 RIPA buffer 洗 3 遍，80

6、0l/ 遍，RIPAbuffer 有时候会破坏琼脂糖珠-抗原抗体复合物内部的结合，可以使用 PBS14. 用 60l 2 上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，缓冲液的量依据上样多少的需要而定（ 60 l 足够上三道）15. 将上样样品煮 5min ，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min 变性。RIPA Buffer 配制：基础成分：Tris-HCl （缓冲液成分，防止蛋白变性）NaCl （盐份，防止非特异蛋白聚集）NP-40（非离子去污剂，提取蛋白；用H2O 配制成 10%储存液）去氧胆酸钠（离

7、子去污剂，提取蛋白；用H2O 配制成 10%储存液；避光保存）注意：准备激酶（致活酶）实验时，不要加去氧胆酸钠，因为离子型去污剂能够使酶变性，导致活性丧失。RIPA 蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟 （PMSF ）（用异丙醇配制成200mM 的储存液，室温保存）EDTA（钙螯合剂； 用 H2O 配制成 100mM 的储存液， PH 7.4）亮抑酶肽（ Leupeptin ）（用 H2O 配制成 1mg/ml 的储存液，分装， -20保存）抑蛋白酶肽（ Aprotinin ）（用 H2O 配制成 1mg/ml 的储存液，分装， -20保存）胃蛋白酶抑制剂（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml

8、的储存液，分装， -20保存）RIPA 磷酸（酯）酶抑制剂激活的 Na3VO4（用 H2O 配制成 200mM 的储存液，见 SodiumOrthovanadate Activation Protoco ）NaF（ 200mM 的储存液，室温保存）注意：在准备做磷酸（酯）酶实验的时候，不加磷酸酯酶抑制剂工作液配制：配制 100ml 的 modified RIPA buffe ：1. 称取 790mg 的 Tris-Base，加到 75ml 去离子水中，加入 900mg 的 NaCl ，搅拌，直到全部溶解， 用 HCl 调节 PH 值到7.42. 加 10 ml 10% 的 NP-403. 加

9、2.5 ml 10% 的去氧胆酸钠，搅拌，直到溶液澄清4. 加 1 ml 100mM 的 EDTA ，用量筒定容到100ml ， 2-8保存5. 理论上，蛋白酶和磷酸酯酶抑制剂应该在使用当天同时加入（抑蛋白酶肽，亮抑酶肽 ,胃蛋白酶抑制剂各 100 l;PMSF, Na3VO4, NaF 各 500 l ），但是 PMSF 在水溶液中很不稳定， 30 分钟就会降解一半， 所以 PMSF 应该在使用前现加，其他抑制剂成分可以在水溶液中稳定5 天。各种成分在工作液中的终浓度：* Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4* NP-40: 1%* 去氧胆酸钠： 0.25%* NaCl: 150

10、mM* EDTA: 1 mM* PMSF: 1 mM* 抑蛋白酶肽，亮抑酶肽 ,胃蛋白酶抑制剂 : 各 1 g/ml* Na3VO4: 1 mM* NaF: 1 mM三、实验流程：（ 1）转染后 24-48 h 可收获细胞， 加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂） ，冰上裂解 30min, 细胞裂解液于4C ，最大转速离心30 min 后取上清；（ 2）取少量裂解液以备 Western blot 分析，剩余裂解液加 1g 相应的抗体加入到细胞裂解液， 4C 缓慢摇晃孵育过夜；（3）取 10l protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗 3 次，每次 3,000 rpm 离心 3 min

11、 ；（ 4）将预处理过的 10l protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4C 缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与protein A 琼脂糖珠偶连；（ 5）免疫沉淀反应后， 在 4C 以 3,000 rpm 速度离心 3 min ，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用 1ml 裂解缓冲液洗 34 次；最后加入 15l 的 2SDS 上样缓冲液，沸水煮 5 分钟；（ 6） SDS-PAGE, Western blotting 或质谱仪分析。通过免疫共沉淀确定结合蛋白1用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的

12、EBC 裂解缓冲液中。2将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上 4以最大速度离心15 min 。3收集上清 （约 30 ml ）并加入 30g 的适当抗体， 4 摇动免疫沉淀物 1 h。4加入 0.9 ml 的蛋白质 A-Sepharose 悬液， 4摇动免疫沉淀物 30 min 。5用含 900 mmol/L NaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物，再重复洗 5 次。最后，用 NETN 洗一次。6吸出混合物的液体部分。加入 800l 的 1SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4 min 。7将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10mA的恒定电流

13、下电泳过夜。8通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。9从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用 1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min 。10 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。11 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或 494A 机器上进行自动 Edman 降解测序。四、注意的问题：（ 1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或 Triton X-100) 。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。 不能用高浓度的变性剂 （ 0.2 SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的cocktailer 。（ 2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用（ 3）使用对照抗体：单克隆抗体：正