MS-联用仪器及应用3

1、质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-221一、概述一、概述 generalization质谱：纯物质结构分析质谱：纯物质结构分析色谱：化合物分离色谱：化合物分离色谱色谱-质谱联用：共同优点质谱联用：共同优点gc-ms；lc-ms；cze-ms（毛细管电泳（毛细管电泳-质谱）质谱）困难点：困难点：载气载气(或流动液或流动液)的分离；的分离；出峰时间监测；出峰时间监测；仪器小型化；仪器小型化；关键点：接口技术关键点：接口技术(分子分离器分子分离器)m/z15294357859911314271质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-222二、二、gc-ms联用仪器联用仪器

2、hyphenated technology of gc-mssamplesample 58901.0 deg/minhewlettpackardhewlettpackard5972amass selective detectordcba abcdgas chromatograph (gc)mass spectrometerseparationidentificationbacdadbcms质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-223gc-ms中的分子分离器中的分子分离器 分子分离器类型：分子分离器类型： 微孔玻璃式、半透膜式和喷射式三种。微孔玻璃式、半透膜式和喷射式三种。 喷射式分

3、子分离器：喷射式分子分离器： 由一对同轴收缩型喷嘴构成，喷嘴被封在一真空室中，如由一对同轴收缩型喷嘴构成，喷嘴被封在一真空室中，如图所示。可做成多级。图所示。可做成多级。质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-224四极杆质量分析器四极杆质量分析器（quadrupole mass filter）+electron beamabcsample inion beam质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-225仪器结构仪器结构色谱-四极杆质谱仪结构示意图质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-226四极杆质量分离器四极杆质量分离器质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用20

4、21-10-227仪器与结构仪器与结构质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-228飞行时间质量分析器飞行时间质量分析器质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-229三、三、lc-ms联用仪器联用仪器hyphenated technology of lc-ms1. 1. 大气压电离技术（大气压电离技术（apiapi）（1）电喷雾电离（）电喷雾电离（ api electrospray）rayleighlimitreached+-+-+-+-evaporation+charged droplets试样离子准分子离子analyte ions solvent ion cluster

5、ssalts/ion pairsneutrals+-其他离子质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2210electrospray， api 电喷雾电离电喷雾电离流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘；气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2211electrospray， api 电喷雾电离电喷雾电离电喷雾产生多电荷离子，电喷雾产生多电荷离子，相对分子质量相对分子质量mr计算：计算：选相邻峰，电荷选相邻峰，电荷n，

6、 n +1m1=(mr + n)/2m2=(mr + n+1)/ (n+1)计算结果如计算结果如表。表。不适用于非不适用于非极性化合物极性化合物质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2212（2）大气压化学电离（）大气压化学电离（ apci ）热喷雾热喷雾(100-120 c)，化学电离化学电离;适用于热稳定化合物分析适用于热稳定化合物分析质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2213大气压化学电离（大气压化学电离（ apci ）dielectric capillaryhigh wattage heaterhplc inletcorona discharge needl

7、evaporizernebulizer gas+质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-22142.2.离子阱质量分析器离子阱质量分析器 特定特定m/z离子在阱内一离子在阱内一定轨道上稳定旋转，改变定轨道上稳定旋转，改变端电极电压，不同端电极电压，不同m/z离子离子飞出阱到达检测器；飞出阱到达检测器；质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-22153. lc-ms (离子阱离子阱)联用仪器结构示意图联用仪器结构示意图质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-22164. lc-ms (四极杆四极杆)联用仪器结构示意图联用仪器结构示意图质谱分析法质谱分析法联用仪器及应

8、用2021-10-2217十、联用技术a). lc/esi-ms 1). hplc/esi-ms质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2218b). fplc/hplc/esi-ms质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2219c). 浓缩装置与浓缩装置与esi-ms联用联用质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2220d). 流速与检测器的性质流速与检测器的性质质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2221e). 注意事项注意事项采用挥发性缓冲液，如醋酸铵、甲酸铵、醋酸、三氟采用挥发性缓冲液，如醋酸铵、甲酸铵、醋酸、三氟乙酸乙酸(tfa)、七氟

9、丁酸、七氟丁酸(hfba)等代替硼酸盐、磷酸盐等代替硼酸盐、磷酸盐和硫酸盐等；和硫酸盐等；ph值应保持相同；值应保持相同；应采用挥发性的离子对试剂。但应注意更换离子对试应采用挥发性的离子对试剂。但应注意更换离子对试剂后保留时间的变化；剂后保留时间的变化；lc用的有机溶剂应与离子化方式一致。反相用的有机溶剂应与离子化方式一致。反相lc用的用的极性溶剂与极性溶剂与esi相匹配；正相相匹配；正相lc用的非极性溶剂与用的非极性溶剂与apci相匹配；相匹配；质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-22222). ce/esi-msa). 示意图示意图质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-

10、10-2223b). sheath liquid ph 的影响的影响质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2224c). 注意事项注意事项 sheath liquid的成份通常为甲醇、甲氧基甲醇、的成份通常为甲醇、甲氧基甲醇、乙腈并含乙腈并含10 20%甲酸、乙酸或水；甲酸、乙酸或水；sheath liquid流速及流速及ph大小。流速一般为大小。流速一般为2 5 l/min；缓冲液应为挥发性溶剂，如：乙酸、乙酸铵、碳酸铵缓冲液应为挥发性溶剂，如：乙酸、乙酸铵、碳酸铵和甲酸。缓冲液的纯度应较高，以减少背景噪音。和甲酸。缓冲液的纯度应较高，以减少背景噪音。降低待测成分的流速，以提高灵

11、敏度。降低待测成分的流速，以提高灵敏度。注意毛细管内径对灵敏度的影响。注意毛细管内径对灵敏度的影响。20m i.d. 质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2225十一、样品的制备十一、样品的制备超滤。采用不同截止分子量的滤膜过滤。超滤。采用不同截止分子量的滤膜过滤。溶剂提取。将待测成分自水相提取至有机相是常用的溶剂提取。将待测成分自水相提取至有机相是常用的方法之一。这种方法的优点是应用广泛；溶剂、方法之一。这种方法的优点是应用广泛；溶剂、ph、离子对试剂等均可选择，以利提取；可浓集待测成分。离子对试剂等均可选择，以利提取；可浓集待测成分。缺点是耗时，有时回收率较低。缺点是耗时，有

12、时回收率较低。固相提取。主要是使用固相提取。主要是使用c18、c8、c4萃取小柱。具体萃取小柱。具体方法可参考公司说明书。方法可参考公司说明书。色谱柱纯化。色谱柱纯化。质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2226串联质谱技术串联质谱技术(msn)1). 碰撞诱导解离碰撞诱导解离(collisional-induced dissociation, cid)技术技术 在离子阱(ion trap)、triple stage quadrupole、fticr、磁质谱仪及混合的串联质谱仪上可实现cid反应。a). 由母离子寻找子离子由母离子寻找子离子(parent ions to daug

13、hter ions)质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2227b). 由子离子寻找母离子由子离子寻找母离子(daughter ions to parent ions)质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2228c). 中性丢失(neutral loss)质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2229). cid技术在肽测序方面的应用技术在肽测序方面的应用含有 n terminal 碎片离子称为：a, b or c；含有c terminal的碎片离子称为： x, y or z. de novo 蛋白质测序质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-

14、2230肽肽cid碎裂反应中出现的重排离子碎裂反应中出现的重排离子质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2231residuealaninearginineasparagineaspartic acidcysteineglutamic acidglutamineglycinehistidineisoleucineleucinelysinemethioninephenylalanineprolineserinethreonine3-lettercodealaargasnaspcysgluglnglyhisileleulysmetpheproserthr1-lettercodearnd

15、ceqghilkmfpstimmoniumion*44129878876102101301108686101104120706074relatedions* 59,70,73,87,100,1127070 56,84,129 82,121,123,138,16644,7244,7270,84,112,1296191 质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2232formulae to calculate fragment ion massesn is the mass of n-terminal group,c is the mass of c-terminal group, m

16、is mass of the sum of the neutral amino acid residue masses ion typeion massan+m-coa*a-nh3aa-h2oa+(a+h)/2bn+mb*b-nh3bb-h2ob+(b+h)/2cn+m+nh3da-partial side chainvy-complete side chainwz-partial side chainxc+m+coyc+m+h2y*y-nh3yy-h2oy+(y+h)/2zc+m-nh质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2233低能低能(low energy) cid特点特点:

17、a) 反应发生在四极杆分析器和离子阱分析器；反应发生在四极杆分析器和离子阱分析器；b) 质谱图中出现质谱图中出现 n terminal 碎片离子：碎片离子：a, b or c 和有和有c terminal的碎片离的碎片离子：子： x, y or z. 但主要是形成但主要是形成 a, b 和和 y系列离子。系列离子。c) 在碎裂过程中易丢失中性小分子在碎裂过程中易丢失中性小分子nh3 和和h2o， 分别形成分别形成 a*,b* 和和 y* 和和ao,bo 和和yo。高能高能(high energy) cid特点特点:a) 反应发生在磁质谱分析器和飞行时间分析器；反应发生在磁质谱分析器和飞行时间分

18、析器；b) 质谱图中出现质谱图中出现 n terminal 碎片离子：碎片离子：a, b or c 和有和有c terminal的碎片离的碎片离子：子： x, y or z. 但主要是形成但主要是形成 a, b 和和 y系列离子。系列离子。post source decay特点：特点：质谱图类似高能质谱图类似高能cid谱。谱。3). cid分类分类质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-22344) 电子捕获碎电子捕获碎裂裂(electron capture dissociation, ecd)反应在肽反应在肽测序方面的应用测序方面的应用亮氨酸异亮氨酸h2nchcchohoch3ch

19、2ch3h2nchcch2ohochch3ch3质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2235八、八、esi 质质谱谱图图的的解解释释1). 蛋白质分子量的测定正离子质谱蛋白质分子量的测定正离子质谱esi mass spectrumm + nhn+nn +18 .15901nh) 1n(mr0 .1713nnhmrmr: 平均分子量deconvoluted mass spectrum 质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2236). 核苷酸分子量的测定负离子质谱核苷酸分子量的测定负离子质谱质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2237). 混合肽的质量测定

20、混合肽的质量测定purificationc18, c8 and c4metal coatedtip dimmer: 2-8 mnanospray capillaryelution volume 500-1000 nl去除小分子化合物去除小分子化合物质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2238质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2239影响影响esi因素因素：a) 样品的样品的pka 和溶液的和溶液的ph。样品在电喷雾溶液中是否已预先形成离子取决于样。样品在电喷雾溶液中是否已预先形成离子取决于样品的品的pka值。在低值。在低ph值条件下有利于样品分子质子化，提高值条件

21、下有利于样品分子质子化，提高ph导致灵敏度和导致灵敏度和分子所带电荷的数目减少。在正离子检测中，溶液分子所带电荷的数目减少。在正离子检测中，溶液ph应较低，可用醋酸、三应较低，可用醋酸、三氟乙酸氟乙酸(tfa)调节。溶液调节。溶液ph通常至少低于样品的通常至少低于样品的pka 2个单位。在负离子检测个单位。在负离子检测中，溶液中，溶液ph应较高，可用氨水调节，使溶液应较高，可用氨水调节，使溶液ph比样品比样品pka高高2个单位。个单位。b) 溶剂的性质。溶剂应具有较低的汽化点，有较低的黏度和表面张力。常用的溶剂的性质。溶剂应具有较低的汽化点，有较低的黏度和表面张力。常用的esi溶剂有醇类、乙腈

22、、丙酮、水等。常用混合溶剂及添加剂，如甲酸、乙酸、溶剂有醇类、乙腈、丙酮、水等。常用混合溶剂及添加剂，如甲酸、乙酸、氨及挥发性缓冲液。氨及挥发性缓冲液。c) 去溶剂时干燥气体的温度和流速。应保持较高的温度及流速以利于去溶剂。但去溶剂时干燥气体的温度和流速。应保持较高的温度及流速以利于去溶剂。但也应注意过高的温度可能导致样品分解。也应注意过高的温度可能导致样品分解。d) 不能使用不挥发的无机盐缓冲液作为不能使用不挥发的无机盐缓冲液作为esi的溶剂的溶剂质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2240九、基质辅助激光解吸电离技术的应用九、基质辅助激光解吸电离技术的应用maldi-tof

23、ms质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2241basic components of a linear (upper panel) and reflecting (lower panel tof mass spectrometer. 质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-22421). 常用的常用的 maldi matrices at 337 nm(n2).matrix application 2,5-dihydroxybenzoic acid (dhb)2,5-二羟基苯甲酸二羟基苯甲酸peptides, proteins, lipids, and oligosac

24、carides 3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid (sinapinic acid) 3,5-二甲氧基羟基肉硅酸二甲氧基羟基肉硅酸(反式反式)peptides, proteins, and glycoproteins a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (chca) 腈基羟基肉硅酸腈基羟基肉硅酸peptides, proteins, lipids, and oligonucleotides 质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-22432). maldi -tof-ms可容忍下列物质的最高浓度可容忍下列物质的最高浓度u

25、rea 0.5m guanidine-hcl 0.5m dithiothreitol (dtt)0.5m glycerol 1% alkali metal salts 0.5m tris buffer 0.05m nh4hco3 0.05m phosphate buffer 0.01m detergents (not sds) 0.1% sds 0.01% 质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2244maldi-tof spectra of bovine insulin 3). 蛋白质分子量的测定蛋白质分子量的测定m + na, k li 质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用202

26、1-10-2245maldi peptide map4). 肽分子量的测定肽分子量的测定质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-22465). 肽序列的测定肽序列的测定a). cid测序，方法与测序，方法与esi相同相同.质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2247psd mass spectrum of substance p in chca employing re-tof-ms. 15 kv accelerating potential, 50 laser pulses averaged for each reflector voltage segment. b). psd测序测序质谱分析法质谱分析法联用仪器及应用2021-10-2248ladder sequencing of the adrenocorticotropic hormone (acth) fragment 18-39 utilizing the cpy dilution technique and maldi linear de-tof-ms. 25 kv accelerating potential, 150 ns pulse delay, 1.30 kv pulse, 50 laser pulses averaged for each spectru