微生物的培养

1、第五章第五章 微生物营养微生物营养与培养基与培养基营养营养(nutrition)：生物体从外部环境中摄取对其生命活：生物体从外部环境中摄取对其生命活动必须的能量和物质，以满足正常生长和繁殖需要的一动必须的能量和物质，以满足正常生长和繁殖需要的一种最基本的生理功能。种最基本的生理功能。营养物营养物(nutrient)：具有营养功能的物质。：具有营养功能的物质。 营养物提供生命活动的结构物质、能量、代谢调节物质营养物提供生命活动的结构物质、能量、代谢调节物质和良好的生理环境。和良好的生理环境。一些微生物可利用非物质形式的能源一些微生物可利用非物质形式的能源光能。光能。 存在方式存在方式 有机物：蛋

2、白质、糖、有机物：蛋白质、糖、类类脂、核酸、维生素、降脂、核酸、维生素、降解产物、代谢中间产物解产物、代谢中间产物无机盐灰分无机盐灰分 水水 细胞湿重的细胞湿重的70%90%一般生物能利用的，微生物能利用；一般生物能利用的，微生物能利用；一般生物不能利用的，微生物也能利用；一般生物不能利用的，微生物也能利用；对一般生物有害的，微生物还能利用对一般生物有害的，微生物还能利用。微生物是杂食性的：微生物是杂食性的：六种营养要素六种营养要素 功能功能: :营养物质是微生物新陈代谢和一切生命活动的物质基础，失营养物质是微生物新陈代谢和一切生命活动的物质基础，失去这个基础，生命也就停止。去这个基础，生命也

3、就停止。（一）碳源（一）碳源(carbon source) 提供微生物营养所需碳元素的营养源。提供微生物营养所需碳元素的营养源。 有机碳源：有机碳源：蛋白质，核酸，蛋白质，核酸，淀粉淀粉，葡萄糖等葡萄糖等 无机碳源：无机碳源： co2 , na2co3 , caco3等等 淀粉能为微生物的生命活动提供最初能量来源的化学物质能为微生物的生命活动提供最初能量来源的化学物质（键能）或辐射能（离子的波长和频率）。（键能）或辐射能（离子的波长和频率）。（二）能源（二）能源(energy source)异养微生物的碳源同时也是能源异养微生物的碳源同时也是能源无机物：化能自养微生物的能源无机物：化能自养微生

4、物的能源能源谱能源谱化学物质化学物质辐射能：光能自养和光能异养微生物的能源辐射能：光能自养和光能异养微生物的能源有机物：化能异养微生物的能源有机物：化能异养微生物的能源 有机氮源：蛋白胨、黄豆粉、玉米浆有机氮源：蛋白胨、黄豆粉、玉米浆 无机氮源：无机氮源：nh4no3、(nh4)2so4 气态氮源：大气气态氮源：大气n2（三）氮源（三）氮源(nitrogen source)凡能提供微生物营养所需氮元素的营养源。凡能提供微生物营养所需氮元素的营养源。氮源一般不作能源。氮源一般不作能源。蛋白胨是是将肉、蛋白质（酪素）或明胶用酸、碱或蛋白酶水解后干燥而成的外观呈淡黄色的粉剂，具有肉香的特殊气息。动物

5、性蛋白胨：胰胨（tryptone）、肉胨、骨胨植物性蛋白胨：大豆蛋白胨（soy peptone）单功能：单功能： 辐射能辐射能双功能：双功能： 还原态无机养料，如还原态无机养料，如nh4+既是硝酸盐细菌的能既是硝酸盐细菌的能 源，又是氮源源，又是氮源三功能：三功能： n c h o类营养物质常是异养微生物的能类营养物质常是异养微生物的能 源，碳源兼氮源，如大部分复杂的天然有机物：花生饼粉、玉源，碳源兼氮源，如大部分复杂的天然有机物：花生饼粉、玉米浆等米浆等 一种营养物具有一种以上营养要素的功能一种营养物具有一种以上营养要素的功能无机盐的生理功能无机盐的生理功能无机盐无机盐大量元素大量元素微量元

6、素微量元素一般功能一般功能特殊功能特殊功能细胞内一般分子成分细胞内一般分子成分 (p、s、ca、mg、fe等等)生理调节物质生理调节物质渗透压的维持渗透压的维持 (na+等等) 酶的激活剂酶的激活剂 (mg等等) ph的稳定的稳定化能自养菌的能源化能自养菌的能源 (s、fe2+、nh4+、no2-等等) 无氧呼吸时的氢受体无氧呼吸时的氢受体(no3-、so42-等等) 酶的激活剂酶的激活剂 (cu2+、mn2+、zn2+等等)特殊分子结构成分特殊分子结构成分 (co、mo等等)固氮酶一类对微生物正常代谢必不可少且又不能从简单的碳源，一类对微生物正常代谢必不可少且又不能从简单的碳源，氮源自行合成

7、的、所需极微量的有机物。氮源自行合成的、所需极微量的有机物。培养基中生长因子来源：培养基中生长因子来源：酵母膏、玉米浆、麦芽汁等。酵母膏、玉米浆、麦芽汁等。(五五) ) 生长因子生长因子(growth factor)作用：细胞重要化学物质，辅酶或酶活化作用：细胞重要化学物质，辅酶或酶活化所需所需。狭义：维生素狭义：维生素 广义：维生素、氨基酸、碱基、脂肪酸等广义：维生素、氨基酸、碱基、脂肪酸等 生理作用：生理作用： 细胞组成成分细胞组成成分 生化反应溶剂生化反应溶剂 化学、生理反应介质化学、生理反应介质 物质运输媒体物质运输媒体 调节细胞温度调节细胞温度 维持细胞的渗透压维持细胞的渗透压 （六

8、）水（六）水存在状态：游离态（溶剂）和结合态（结构组成）存在状态：游离态（溶剂）和结合态（结构组成）aw =p/po p: 溶液的蒸汽压溶液的蒸汽压 po:纯水的蒸汽压纯水的蒸汽压 水活度需等渗适宜。水活度需等渗适宜。 微生物适宜生长的微生物适宜生长的aw为为0.60.998之间。之间。在常温常压下，纯水的在常温常压下，纯水的aw为为1.00在同温同压，某溶液的饱和蒸汽压与纯水的饱和蒸汽压之比。在同温同压，某溶液的饱和蒸汽压与纯水的饱和蒸汽压之比。 依碳源不同：依碳源不同： 异养型异养型(heterotrophs): 不能以不能以co2为主要或唯一碳源为主要或唯一碳源 自养型自养型(autot

9、rophs): 能以能以co2为主要或唯一碳源为主要或唯一碳源第二节第二节 微生物营养类型微生物营养类型依能源不同：依能源不同： 光能营养型光能营养型(phototrophs): 光反应产能光反应产能 化能营养型化能营养型(chemotrophs):物质氧化产能物质氧化产能 依生长因子的不同：依生长因子的不同： 原养型原养型(prototroph)或野生型或野生型(wild type) 营养缺陷型营养缺陷型(auxotroph) 微生物的营养类型微生物的营养类型 营养类型营养类型能能 源源碳源碳源实例实例光能自养型光能自养型光能光能co2蓝细菌蓝细菌紫硫细菌紫硫细菌绿硫细菌绿硫细菌藻类藻类光能

10、异养型光能异养型光能光能co2及及简单有机物简单有机物红螺细菌红螺细菌化能自养型化能自养型 无机物无机物co2硝化细菌硝化细菌硫化细菌硫化细菌铁细菌铁细菌氢细菌氢细菌 化能异养型化能异养型有机物有机物有机物有机物绝 大 多 数 微绝 大 多 数 微生物，生物，原生动物原生动物v 寄生型寄生型(parasitism) 寄生于活的生物体寄生于活的生物体 v 腐生型腐生型(saprophytism) 寄生于死亡的生物有机体寄生于死亡的生物有机体化能异养型化能异养型营养类型划分不是绝对的，不同生活条件下，可相互转变。营养类型划分不是绝对的，不同生活条件下，可相互转变。异养微生物：至少需提供一种大量有机

11、物才能满足其正常要求的微生物，异养微生物：至少需提供一种大量有机物才能满足其正常要求的微生物，即 其 碳 源 必 须 是 有 机 物 ， 氢 供 体 是 有 机 物 ； 能 源 则 可 以 利即 其 碳 源 必 须 是 有 机 物 ， 氢 供 体 是 有 机 物 ； 能 源 则 可 以 利 用氧化有机物或吸收日光能而获得。用氧化有机物或吸收日光能而获得。 自养微生物：能利用无机碳源自养微生物：能利用无机碳源异养微生物：必须利用有机碳源异养微生物：必须利用有机碳源第第三三节节 细胞对营养物质的吸收细胞对营养物质的吸收 营养物质的吸收与代谢产物的分泌，涉及到物质的运输、营营养物质的吸收与代谢产物的

12、分泌，涉及到物质的运输、营养物吸收至胞内被利用、代谢物分泌到胞外以免积累，这就养物吸收至胞内被利用、代谢物分泌到胞外以免积累，这就是物质运输过程。是物质运输过程。在营养物质运送方面，细胞壁仅简单地排阻分子量过大在营养物质运送方面，细胞壁仅简单地排阻分子量过大(600da)的溶质进入的溶质进入, 而具有磷脂双分子层和嵌合蛋白分子而具有磷脂双分子层和嵌合蛋白分子的细胞膜则是控制营养物质进入和排除的主要屏障。的细胞膜则是控制营养物质进入和排除的主要屏障。 离子化合物：弱快强慢（极性）离子化合物：弱快强慢（极性） 通透性与吸收是不同概念通透性与吸收是不同概念 一般大分子先水解为小分子，再吸收一般大分子

13、先水解为小分子，再吸收 脂溶性物质：易透过脂溶性物质：易透过一一、单纯扩散、单纯扩散/ /自由扩散自由扩散 (simple diffusion)二、促进扩散二、促进扩散 (facilitated diffusion)载体蛋白载体蛋白(carrier protein)，即透性酶（大多为诱导酶），即透性酶（大多为诱导酶），有底物特异性，每种载体蛋白运输相应的物质。载体蛋有底物特异性，每种载体蛋白运输相应的物质。载体蛋白可加快运输速度，但不能逆浓度运输。白可加快运输速度，但不能逆浓度运输。单纯扩散、促进扩散、主动运输单纯扩散、促进扩散、主动运输 ：被运输的溶质分子不发被运输的溶质分子不发生改变。生改

14、变。 3、主动运输、主动运输 (active transport)特点：特点： 是微生物吸收营养的主要方式是微生物吸收营养的主要方式 可逆浓度梯度运输，耗能可逆浓度梯度运输，耗能 需载体蛋白，有特异性需载体蛋白，有特异性运输运输有机离子、无机离子、氨基酸、乳糖等糖类有机离子、无机离子、氨基酸、乳糖等糖类 需要特异性载体蛋白需要能量来改变载体蛋白的构象需要特异性载体蛋白需要能量来改变载体蛋白的构象亲和力改变亲和力改变蛋白构象改变蛋白构象改变耗能耗能质子动势质子动势=质子化学梯度质子化学梯度+膜电位梯度膜电位梯度 特点：特点： 属主动运输类型属主动运输类型 溶质分子发生化学修饰溶质分子发生化学修饰

15、 定向磷酸化定向磷酸化 需复杂的运输酶系参与需复杂的运输酶系参与 运输葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等运输葡萄糖、果糖、甘露糖、嘌呤、核苷、脂肪酸等 能量来源能量来源pep 4、基团转位、基团转位 (group translocation)膜对大多数磷酸化合物具有高度的不渗透性。膜对大多数磷酸化合物具有高度的不渗透性。每输入一个葡萄糖分子，就要消耗一个每输入一个葡萄糖分子，就要消耗一个atp 的能量。的能量。主要依赖磷酸烯醇式丙酮酸主要依赖磷酸烯醇式丙酮酸(pep)和磷酸转移酶系统和磷酸转移酶系统(pts)。pep+ hprei丙酮酸丙酮酸 + p-hprp-hpr +糖糖eii糖糖

16、-p+hpr1. 1. 热稳定性载体蛋白热稳定性载体蛋白(heat stable carrier protein ,hpr) 的激活的激活 2. 糖磷酸化后运入膜内糖磷酸化后运入膜内 培养基培养基(medium，culture medium)：是一种人工配制的、：是一种人工配制的、适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。适合微生物生长繁殖或产生代谢产物用的混合养料。第四节第四节 培养基培养基（一）五个原则（一）五个原则1、目的明确（根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基）、目的明确（根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基）培养什么微生物、获得什么产物、用途培养什么微生物、获得什么产物

17、、用途二、选择和配制培养基的原则和方法二、选择和配制培养基的原则和方法2、营养协调、营养协调营养协调营养协调(注意营养物的浓度和配比，特别是碳氮比注意营养物的浓度和配比，特别是碳氮比c/n比比)c/n比比: 微生物培养基中所含的碳源中的碳原子与氮源中氮微生物培养基中所含的碳源中的碳原子与氮源中氮原子的摩尔数之比。不是简单的某碳源的重量与氮源的重量原子的摩尔数之比。不是简单的某碳源的重量与氮源的重量之比。因为，不同种类的碳源和氮源，其中含碳量和含氮量之比。因为，不同种类的碳源和氮源，其中含碳量和含氮量差别很大。差别很大。一般培养基的一般培养基的c/n比为比为100/0.52 。以含氮量来看：以含

18、氮量来看：nh3(82%)co(nh2)2(46%)nh4no3(35%)(nh4)2co3(29.2%)(nh4)2so4(21%) ph 渗透压和水活度渗透压和水活度 氧化还原电位氧化还原电位3、物理化学条件适宜、物理化学条件适宜:ph：微生物有最佳生长：微生物有最佳生长ph微生物在生长过程中培养基微生物在生长过程中培养基ph值可能发生的变化值可能发生的变化 ： 在含糖基质上生长在含糖基质上生长,会产酸而使会产酸而使ph下降，下降， 在分解蛋白质和氨基酸时在分解蛋白质和氨基酸时, 会产会产nh3而使而使ph上升，上升， 以以 (nh4)2so4 作作n 源源 , 会过剩会过剩 so4 2-

19、, 而使而使ph下降，下降， 分解利用阳离子化合物如：分解利用阳离子化合物如：nano3, 会过剩会过剩 na+ 而使而使 ph 上升。上升。 渗透压渗透压(osmotic pressure): 高浓度溶液向低浓度溶液渗透时，高浓度溶液向低浓度溶液渗透时，其溶质分子所产生的压力。其溶质分子所产生的压力。 高渗溶液会导致微生物细胞发生质壁分离高渗溶液会导致微生物细胞发生质壁分离 低渗溶液会导致微生物细胞吸水膨胀甚至破裂低渗溶液会导致微生物细胞吸水膨胀甚至破裂 4、原料来源的选择、原料来源的选择组合培养基组合培养基(defined medium) ，或称合成培养基，或称合成培养基 (synthet

20、ic medium)是一类用多种高纯化学试剂配制的、各成分（包含微是一类用多种高纯化学试剂配制的、各成分（包含微量元素）的量都确切知道的培养基。如培养细菌所用量元素）的量都确切知道的培养基。如培养细菌所用的葡萄糖铵盐的葡萄糖铵盐 培养基，培养放线菌的淀粉硝酸盐培养培养基，培养放线菌的淀粉硝酸盐培养基（高氏一号）。基（高氏一号）。一般用于研究工作（代谢、遗传分析）一般用于研究工作（代谢、遗传分析） 。优点：组份精确、重复性好。优点：组份精确、重复性好。 缺点：配制繁琐，成本较高，缺点：配制繁琐，成本较高， 培养菌类有限培养菌类有限培养基类型培养基类型依对培养基成分的了解：依对培养基成分的了解：培

21、养基类型培养基类型依对培养基成分的了解：依对培养基成分的了解： 天然培养基天然培养基(complex medium, undefined medium)， 指一些利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培指一些利用动、植物或微生物体或其提取物制成的培 养基，成分未知。如培养细菌所用的肉汤蛋白胨培养养基，成分未知。如培养细菌所用的肉汤蛋白胨培养 基，培养酵母菌的麦芽汁培养基等。基，培养酵母菌的麦芽汁培养基等。优点：优点：取材方便、营养丰富、种类多样、配制方便取材方便、营养丰富、种类多样、配制方便缺点：成分不稳定，实验结果重复性差缺点：成分不稳定，实验结果重复性差 固体培养基固体培养基(solid

22、medium)，一般加有凝固剂，一般加有凝固剂， 凝固剂含量一般为凝固剂含量一般为12。作为凝固剂的条件：不被微生物分解利用，生长温度范围内保持固体作为凝固剂的条件：不被微生物分解利用，生长温度范围内保持固体状态，凝固点温度对微生物无害，不因灭菌而破坏，透明度好、配制状态，凝固点温度对微生物无害，不因灭菌而破坏，透明度好、配制方便、价格低。常用的为方便、价格低。常用的为琼脂与明胶。琼脂与明胶。由于固体培养基能提供表面，形成单菌落，因此可用于：菌种分离、由于固体培养基能提供表面，形成单菌落，因此可用于：菌种分离、鉴定、保藏等。鉴定、保藏等。按培养基外观的物理状态：固体、半固体、液体。按培养基外观的物理状态：固体、半固体、液体。 化学化学成分成分营养营养价值价值分解分解性性融化融化温度温度凝固凝固温度温度常用常用浓度浓度透明透明度度粘粘着着力力耐加耐加压灭压灭菌菌琼琼脂脂聚半乳糖聚半乳糖的硫酸酯的硫酸酯无无罕见罕见960c400c1.52%高高强强强强明明胶胶蛋白质蛋白质作氮作氮源源极易极易250c200c512%高高强强弱弱依功能不同：依功能不同