活细胞高速共聚焦成像系统使用说明.doc

1、活细胞工作站使用指南1. 开机顺序：1） 分为上下两列开关：先下列按照一、三、二、四、五的顺序打开，上列依顺序由下向上打开；2） 打开激光器开关；3） 打开电脑；4） 打开气瓶，顺时针缓慢拧开，压力阀上调一小刻度即可；5） 小室加水，要用超纯水（如小瓶没水，请到各自实验室填充） ；6） 选择合适的适配器（ 33mm 培养皿或玻片）后，将细胞放入小室，盖好小室上层小盖。2.打开软件。 桌面双击 Volocity 出现界面1） 新建文件夹（为了保证每次数据的安全性及有序性，要求每次试验都建立新的文件夹）方法：点击 Creat a new library图标选择新建文件夹路径 （C:Ultravie

2、w当时月份的文件夹） 输入文件名 （名称格式为本人姓名 +年月日）点击Creat进入软件界面2） 打开已有的文件夹进行数据处理点击 Open a existing library图标选择新建文件夹路径（ C:Ultraview 当时月份的文件夹 目标文件名）点击 Open进入软件界面3. 软件界面及显微镜界面构成：1） 图 1：软件界面示意图（软件界面分为六部分）1235462） 显微镜界面：图 2：显微镜正面示意图（学生可操作的部分有两部分）：21：目镜下对焦时将“EYE”按亮；将选定的图像转至电脑屏幕时将“L100”按亮12： PFS定焦按钮图 3：显微镜左侧示意图（学生可操作的部分有三部

3、分）311：调焦旋钮2：明场光强调节旋钮，关机前将其拧至最弱3：显微镜粗调及微调选择按钮2图 4：PFS装置4. UltraVIEW VoX 图像采集简要操作流程1) 将样品放入小室，盖好小室上层小盖；2) 打开软件，单击图 1 第三部分中的“ video preview ”图标，点击图 1 第六部分中的打开明场光路；3) 选择合适的物镜后在显微镜下调整样品对焦；4) 点击图 2. 第一部分中的 “ L100”将 显微镜光路切换至共聚焦成像模式；5) 选择合适的激光通路6) 依次调节各路激光的激光功率， 敏感度（ sensitivity ）及曝光时间（exposure time ）；激光功率最

4、大一般控制在 40% 左右，如果荧光较弱，敏感度可以拉的很大，但曝光时间一般最大控制在 500ms 左右。各通道调解后请务必点击右上角的保存按钮。7) 长时间扫描请启动定焦系统：单点采集方法： 点击按亮图 2 中的第二部分， 打开需要定焦的激光或明场通路，旋转图 4 所示的 PFS 装置将焦面调至理想状态， 定焦后 PFS 旋钮不宜再动。多点采集方法： 先选择第一个点，进行至上述步骤 1）-6 ）后， 点击图 1 第一部分中的 video 选择 XY stage ；点击 stage clear allpoints add point; 选择第二个点 add point ，不断重复此步骤直至最后

5、一个点；多点需确定每个点的焦面： 点击按亮图 2 中的第二部分，打开需要定焦的激光或明场通路，点击 stage reviewe points, 旋转 PFS 装置将焦面调至理想状态，点击对话框中的 next 按钮，重复上述步骤，直至最后一个点后按 STOP 结束；保存多点位置： stage save points（如果扫描中途软件死机， 重启后如果软件没有记住你需要的各点，则可以导出保存各点的位置， stage restore points 点击保存的名字）。8) 设定采集程序（主要在图 1 第五部分进行，如下图 5 所示）双击，就会弹出程序设定窗口如图6 所示）。图 5：设定采集程序图 6

6、：程序设定窗口 点击 Channels/Z 选项：左侧为使用通路选项，可通过“+”或“ -”实现通路的增减。右侧为 Z 轴层切设定区域，如果不进行层切，则选 择 “ none ”， 如 果 进 行 层 切 则 选 择“ Ultraview ”选项，同时进行后续选择，如“ capture with this Z-spacing ”为设定层切步进；“ capture this many slices ”为设定总的扫描层数。这两项只能 2 选 1。点击 Time 选项：上半部分设定扫描频率：采用固定的扫描频率选择选项2，填入所需的时间即可，注意后面单位的选择，如果是分钟选 “ Timepointpe

7、r minute”，依次类推。采用可变的扫描频率选择选项3，通过“ +”，填入变化的扫描频率。下半部分设定扫描时长：选择“until stop is clicked ”, 表示采用手动停止的方式。选择第二选项，则填入希望扫描持续的时间即可，同样注意后面单位的选择。点击 points 选项：如果是单点扫描，则“ changing XY using ”选 “none ”，如果是多点扫描， 则“ changing XY using ”选“Ulreview ”。 “Stitches ”不用管 点击 autofocus选项：选择“autofocus at each pointfor every time

8、point ”及“autofocus 点击Reference选项：如果认为所选通路都需要 Z 轴层切，则在 1 选项 中选择“ none ”，如果在所选通路中某一通路不需要层切，那么就选择那个通路，如，在通路中有 DIC 通路，则在此选项中应选择“ DIC”。第二选项设定 的是不需要层切的通路应该拍摄的位置，一般情况下，我们应选择“ zero”或“ middle ”9 ）设定层切范围采用 PFS 定焦后，点击图 1 中第 6 部分中“ ultraview ”中如图所示的按钮，则会对话框进行层切设定：首先点击“set zero ”，然后在后填入扫描上限， 在 后填入扫描下限 （一定要价负号 ）。

9、设定后在任意空白处虚点一下退出该设定界面。10 ）点击图 5 中的红色按钮开始扫描。扫完的图像资料会自动存储在图1 的第四部分，可随时单击点击察看。5关机步骤：点击图 5 中的红色按钮（此时是灰色）停止扫描关闭软件关机上下两列开关， 由下向上关闭关闭激光开关逆时针关闭气瓶6数据处理：1）打开软件，单击图像资料2）图片的浏览：单击图1 的第四部分自动生成保存的图像，图片中所选项目可展示图像的不同层面，例如，选择“ extended focus ” 显示的是各层叠加后的图像；选择“ 3D opacity ”显示的是立体三维的图像；一般如果没有特殊要求， 在浏览，处理及导出图像时请选择 “ exte

10、nded focus ”选项。3）简单常规处理：点击图 1 第一部分中的 tool ，依次进行 auto contrast，remove noise，contrast enhancement，最后再重新 remove noise 一次即可如需将某个范围的细胞单独切出，选中该区域后点击右键 crop to selection 即可随后将切出的细胞重复上述处理过程后导出。4）时间及标尺的添加：点击图 1 第一部分中的 image display选择 show scale 及 show time。标尺的大小可以通过鼠标左右拖动进行选择；相对及绝对时间的选择同样在 image 中进行。5）数据的导出：

11、 图像处理好后， 在图 1 第四部分中单击选择需要导出的图像右键选择 export 在对话框中选择合适的导出路径（C:Ultraview当时月份的文件夹建立自己当天的文件夹） 给导出的图像命名选择合适的格式（如果导出的是movie，请选择 view as quicktimemovie(.mov)格式；如果导出的仅是单张图片，请选择jpg 或 tiff 格式）。6）如何将图片分通道导出：在图 1 的标尺后，将其导出，方法同步骤第二部分中选择5）。，选择合适7） 如何将一个连续的movie 分割成一个个单张图片：选中图像点击图1 第一部分中的 actions merge planes在该图像的下方

12、会自动出现一个新的图像，其文件名后缀为 merged选择该图像，点击图 1 第一部分中的 tools split volumes选择“ put all images into a single file ”，order 选择“ z then channels then timepoints”图像下方会自动生成一个文件夹里面是组成该图像的所有图片。重复步骤5）导出即可。实验中可能出现的状况及注意事项1405 激光问题：如果点击405 通道后无信号出现，首先确认有无激光出现，如果没有激光出现，则在图 1 第 6 部分，如下图拉至“Nikon ti microscope ”栏目下，选择选项后，重新打开激光光闸即会有激光出现。2扫描过程中死机问题：在进行多点扫描过程中，有可能会出现软件的死机问题，所以在扫描过程中并不能完全撒手不管，每隔1-2 小时需进行察看，观察有无死机及焦面漂移问题。死机现象：鼠标呈现“漏斗”状，无法点击任何图标。如果遇到死机，需硬性关闭软件然后重新开启，如果多点最好重新导出多点后再重新点击开始。3. 激光器“ error ”灯亮怎么办 ? 当前气温较高，如果仪器开放时间过长，务必保证试验期间空调打开，如果室温较高