11非中断杂交1061110

1、： 熟悉细菌接合和基因定位分析的原理；熟悉细菌接合和基因定位分析的原理； 掌握大肠杆菌非中断杂交分析的技术；掌握大肠杆菌非中断杂交分析的技术； 理解、区分中断杂交和非中断杂交分析的关键理解、区分中断杂交和非中断杂交分析的关键技术点。技术点。： 母液配制，培养基培母液配制，培养基培制，器具干热、湿热灭菌。制，器具干热、湿热灭菌。 活化菌种，接种，扩活化菌种，接种，扩菌，杂交，涂平板，培养，菌，杂交，涂平板，培养，点种点种a，点种，点种b-g。 实验结果观察统计分实验结果观察统计分析，基因位点距离计算。析，基因位点距离计算。： f因子：因子：dna小环，小环，占染色体占染色体dna的的2% 。大肠

2、杆菌菌株：大肠杆菌菌株：1）f - 菌株菌株2） f + 菌株菌株3）高频重组菌株（）高频重组菌株（hfr）“雄性雄性”“雌性雌性”原点原点致育基致育基因区因区配对区配对区复制区复制区 hfr菌株菌株f-菌株：菌株：hfr染色体从原点断裂，染色体向染色体从原点断裂，染色体向f菌株起始转菌株起始转移。移。 杂交时间：杂交时间： 全部染色体进入全部染色体进入f需要需要100min。f-菌株菌株 f+菌株菌株f+菌株菌株f-菌株菌株 hfr菌株菌株f-不同类型的重组子菌株不同类型的重组子菌株杂交：杂交：随机中断：随机中断：各种条件影响各种条件影响转移随机中断。转移随机中断。完整染色体进入完整染色体进

3、入f细菌的机会很少，完整的细菌的机会很少，完整的f因子转因子转移机会也很低。导致：移机会也很低。导致：1）hfr菌株与菌株与f-菌株的杂交一般不会使菌株的杂交一般不会使f变成变成hfr 或或f+ 。2）hfr染色体上的基因呈梯度转移染色体上的基因呈梯度转移: a b a c b a d c b a 非中断杂交（非中断杂交（interrupted matting）基因定位）基因定位：自然中断自然中断重组的百分率为指标重组的百分率为指标中断杂交（中断杂交（non-interrupted matting）基因定位）基因定位：人为中断接合人为中断接合供体基因在受体中的出现时间为指标供体基因在受体中的出

4、现时间为指标后者比前者操作复杂后者比前者操作复杂两种方法测定两个紧密连锁基因时精度较差（以传两种方法测定两个紧密连锁基因时精度较差（以传统重组作图更好）。统重组作图更好）。杂杂交交基基因因定定位位：hfr品系：品系：csh60 strs，其余性状为野生型（，其余性状为野生型（供体供体） f-品系：品系：csh57 strr ，多重生化缺陷型：，多重生化缺陷型： （met、lue、trp、his、ade or pur、arg、lac、gal） （受体受体） f接受接受hfr不同长度染色体不同长度染色体重组重组各种重组子各种重组子杂交杂交csh57 strr ，多重生化缺陷型，多重生化缺陷型不能合

5、成不能合成 met、lue、trp、his、ade or pur、arg不能利用不能利用 lac、gal 如何选出各种重组子，排除供（父）、受（本）体？如何选出各种重组子，排除供（父）、受（本）体？选择性标记选择性标记(selected marker)基因：基因：目的：选择出全部的重组子，排除杂交中的受体菌。目的：选择出全部的重组子，排除杂交中的受体菌。措施：培养基中不加措施：培养基中不加met和和leu。选什么样的基因？选什么样的基因？反选择性标记反选择性标记(nonselected marker)基因：基因：目的：排除供体菌，同时保证全部的重组子存活。目的：排除供体菌，同时保证全部的重组子

6、存活。选什么样的基因？选什么样的基因？措施：在培养基中添加链霉素措施：在培养基中添加链霉素(str)。met和离和离leu离原点最近离原点最近str离原点最远，使离原点最远，使hfr染色体更多机会进入受体染色体更多机会进入受体本实验所配制的选择培养基：本实验所配制的选择培养基：a培养基：培养基：排除供、受体排除供、受体选择全部重组子选择全部重组子bg培养基：培养基：选择各种重组子选择各种重组子求出重组频率求出重组频率确定基因连锁情况确定基因连锁情况添加物质添加物质 碳源碳源10a琼脂粉琼脂粉水水mgso4硫胺素硫胺素(盐酸盐酸噻胺，噻胺，vb1)精氨酸精氨酸腺嘌呤腺嘌呤色氨酸色氨酸组氨酸组氨酸

7、 链霉素链霉素 a b c d e f g - - 葡萄糖葡萄糖 - 乳糖乳糖 半乳糖半乳糖 ：重组子数目取决于接合细胞数，通常hfr与f细胞数之比为1:1020 。重组子的检出：影印法，单菌落点种法本次实验单菌落点种法单菌落点种法。 供体csh601环菌接种37c 1012h受体csh57lblb1环菌1ml1ml37 c 23h扩菌扩菌lblb0.2 ml4 ml接合接合37 c 振荡100a对照a对照aaaaaa0.1ml0.1ml涂涂a板板点个单菌落点个单菌落37 c 2448h点点a板板37 c 2448hbcdefg点点b-g板板37 c 24 48h观察结观察结果果3个200l3

8、个100l 配制配制各种选择性培养基的基本溶液各种选择性培养基的基本溶液lb液体培养基液体培养基各种选择性培养基的配制各种选择性培养基的配制包装包装各种器皿、用具各种器皿、用具（一）配制各种选择性培养基的基本溶液（一）配制各种选择性培养基的基本溶液 试剂名称试剂名称 10 a 葡萄糖葡萄糖乳糖乳糖半乳糖半乳糖mgso4.7h2o硫胺素硫胺素精氨酸精氨酸色氨酸色氨酸组氨酸组氨酸腺嘌呤腺嘌呤溶液规格溶液规格 (119页）页） 20% 20% 20%0.25m1mg/1ml10mg/ml10mg/ml10mg/ml10mg/ml 配制量配制量 500ml 200ml 25ml25ml25ml25ml

9、25ml25ml25ml25ml（二）配制（二）配制lb液体培养基液体培养基:(周四上午组再多配周四上午组再多配300ml)200ml ，分装：，分装：3瓶瓶/组，组，5ml / 瓶，瓶， 其余交给老师其余交给老师（三）每组包装灭菌（三）每组包装灭菌：培养皿培养皿20个个 接合用的空三角瓶（接合用的空三角瓶（100ml）1个个 牙签牙签200支（支（20支左右一包）支左右一包） (四四)tip头准备头准备 为下次实验准备蓝、黄为下次实验准备蓝、黄tip头各头各1盒盒 用用50ml小三角瓶小三角瓶分装分装：教材p118“lb液”配制中，蒸馏水应为ml添加物质添加物质 碳源碳源10a琼脂粉琼脂粉水

10、水mgso4硫胺素硫胺素精氨酸精氨酸腺嘌呤腺嘌呤色氨酸色氨酸组氨酸组氨酸 链霉素链霉素 2ml10ml2g88ml0.4ml0.4ml0.4ml0.4ml0.4ml0.4ml 0.4ml a b c d e f g - - 葡萄糖葡萄糖 - 乳糖乳糖 半乳糖半乳糖 （每组需（每组需250ml） （每组各需（每组各需30ml)：1. 称取琼脂称取琼脂2. 另取其它各成分于一小椎型瓶中，将琼另取其它各成分于一小椎型瓶中，将琼脂其中混匀。脂其中混匀。3. 灭菌：灭菌：a到到g培养基培养基115灭菌灭菌20min，其它，其它培养基和耗材培养基和耗材121 灭菌灭菌15min 。请大家灭菌时注意把相同灭菌条件的物品放在相请大家灭菌时注意把相同灭菌条件的物品放在相同的灭菌框中。同的灭菌框中。：a培