第二张基因工程制药目的基因的分离

1、1目的基因的分离目的基因的分离2q分离目的基因的方法及原理分离目的基因的方法及原理q目的基因分离方法的选择原则目的基因分离方法的选择原则q目的基因的序列测定目的基因的序列测定3 cloned dna in vitro第一节第一节 分离目的基因的方法及原理分离目的基因的方法及原理145目的基因的来源目的基因的来源 7891011121315方法：合成cdna第一链 5aaaaaa 3 mrna ttttttt 5 cdna 1 oligo(dt)，反转录酶 d ntp, 合成cdna第二链 aaaaaa 3 cdna 2 ttttttt 5 rnase h，dna聚合酶, dntp 5 aaaa

2、aa 3 双链 cdna 3 ttttttt 51920212223242526232728 293031 （见pcr章）432差示文库构建流程f细胞mrna。 f细胞中特异表达的cdna文库（即差示文库）（f细胞cdna第一链）代表f细胞特异表达的基因（h细胞mrna） 。 。 。343536一、根据获得目的基因的目的选择方法一、根据获得目的基因的目的选择方法37二、根据目的基因的特点选择方法二、根据目的基因的特点选择方法38三、根据实验室的设备和条件选择方法三、根据实验室的设备和条件选择方法39第三节第三节 目的基因序列测定目的基因序列测定40一、双脱氧链终止法（一、双脱氧链终止法（san

3、gersanger法）法） 41425gagtcacacttgac 3待测单链dna 3ctg 5引物、klenow酶、datp、dgtp、dctp、dttp和少量-32p-datp 加ddatp反应3actg 53aactg 53agtgtgaactg 5加ddctp反应3cagtgtgaactg 53ctcagtgtgaactg5加ddttp反应3tgaactg 53tgtgaactg 53tcagtgtgaactg5加ddgtp反应3gaactg 53gtgaactg 53gtgtgaactg5gagtcacactt变性凝胶电泳、放射自显影 a c t g 5444546n 47 484

4、950二、化学裂解法（二、化学裂解法（maxam-gilbertmaxam-gilbert法）法） 原理原理 使特定的碱基首先被化学修饰，然后再经化学使特定的碱基首先被化学修饰，然后再经化学处理。如：用硫酸二甲酯使鸟嘌呤甲基化，然处理。如：用硫酸二甲酯使鸟嘌呤甲基化，然后再加哌啶，使甲基化的鸟嘌呤丢失，后再加哌啶，使甲基化的鸟嘌呤丢失，dnadna链链从鸟嘌呤修饰处后的从鸟嘌呤修饰处后的33，5-5-磷酸二酯键断裂。磷酸二酯键断裂。51 自动测序仪基于自动测序仪基于2 2，3-3-双脱氧末端终止法的原理，双脱氧末端终止法的原理，标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号的荧光标记系统由放射性核素改为发特定荧光信号的荧光染料，预先将四种荧光染料与四种双脱氧核苷三磷染料，预先将四种荧光染料与四种双脱氧核苷三磷酸共价相连，使其带有不同的荧光标记。当某一种酸共价相连，使其带有不同的荧光标记。当某一种ddntpddntp掺入到正在合成的掺入到正在合成的dnadna单链分子中时，该单链分子中时，该链的延伸便终止并带有相应的荧光染料。链的延伸便终止并带有相应的荧光染料。 自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装自动测序系统包括电泳分离系统、荧光检测装置、计算机