第二章蛋白质

1、第二章第二章 蛋白质蛋白质(protein)n蛋白质蛋白质(protein)：是由氨基酸为单位组成的是由氨基酸为单位组成的一类重要的生物大分子，是生命的物质基一类重要的生物大分子，是生命的物质基础。础。 蛋白质是一类最重要的生物大分子，英文称protein，意为“最原初的，第一重要的”。第一节 蛋白质通论一、蛋白质的生物学意义蛋白质的功能1、结构物质(角蛋白、胶原蛋白等） 角蛋白(kevatin)是皮肤、毛发和指甲等组织的重要组成成分。是一种抗机械、抗化学刺激的蛋白质，存在于所有高等脊椎动物体中。头发的显微结构n胶原蛋白是一种生物性高分子物质，在动物细胞中扮演结合组织的角色。n其应用领域包括医

2、用材料、化妆品、食品工业、研究用途等。2、催化功能（酶）n所有的生物有机体体内都有酶：人、动物、植物以及细菌、真菌等微生物。n酶是自然界的工具，它们剪切、拼接营养物质等。n酶催化所有生物体必需的代谢活动；比如：在胃内，酶将食物消化为极小的颗粒，以易于转化为体内的能量。n每当物质需要由一种形式转化为另一种形式时，酶都可以起催化作用促使反应加速。n3、运输功能（血红蛋白、血清蛋白） 血红蛋白（hb）是红细胞的主要成分。其功能是在肺部结合氧气，送到全身各组织并将组织中的二氧化碳送到肺部而呼出体外。 4、收缩或运动功能（肌动蛋白、肌球蛋白、纤毛、鞭毛） 收缩蛋白： 肌动蛋白和肌球蛋白 纤毛、鞭毛：从一

3、些原核细胞和真核细胞表面伸出的、能运动的突起。鞭毛和纤毛的运动是由于它们局部弯曲，从基部向顶端波浪式地推进的结果。5、保护和防御功能（免疫球蛋白、干扰素） 免疫球蛋白（ig）：一组具有抗体活性的蛋白质。ig功能区示意图干扰素（ifn）：具有抗病毒繁殖、抗细胞分裂增殖及调节机体免疫三大基本功能。6、调节功能（激素、组蛋白等） 激素（hormone）7、接受与传递调节信息的功能（受体蛋白类、感觉蛋白、味觉蛋白）8、蛋白毒素（霍乱毒素、白喉毒素和各种植物毒蛋白） 霍乱毒素：霍乱菌产生的外毒素，已经证明它是能引起腹泻的毒素。 白喉毒素（dt）：由白喉菌产生的细菌外毒素，可以使机体产生严重的中毒反应，使

4、细胞蛋白质合成受阻，细胞死亡，病变产生。植物毒蛋白蓖麻毒蛋白7mg即可导致成人死亡。有报告称成人误服蓖麻子20粒，小孩约2-7粒，即可引起死亡。 、营养和储存蛋白（卵清蛋白、乳汁中的酪蛋白）10、支架功能（支架蛋白、接头蛋白）11、特殊功能二、蛋白质的组成 1、元素组成 蛋白质分子中主要的元素组成是：蛋白质分子中主要的元素组成是：c c、h h、o o、n n、s s等。其中等。其中n n元素的含量相对稳定，约为元素的含量相对稳定，约为16%16%，占生物组织中所有含氮物质的绝大部分，占生物组织中所有含氮物质的绝大部分，故可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白，故可以将生物组织的含氮量近似地看作

5、蛋白质的含氮量。质的含氮量。蛋白质含量的测定：凯氏定氮法(测定氮的经典方法) 优点：对原料无选择性，仪器简单，方法也简单； 缺点：易将无机氮(如核酸中的氮)都归入蛋白质中,不精确。 一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g蛋白质； 蛋白质含量=氮的量100/16n蛋白质含量测定方法还有： 紫外比色法 双缩脲法 folin酚 考马斯亮蓝g250比色法2、化学组成 单纯蛋白质：水解为-氨基酸 结合蛋白质：单纯蛋白质+辅基n1、根据蛋白质分子形状分球状和纤维状蛋白。n球状蛋白质：分子对称性好，外形接近球状或

6、椭球状，溶解度较好，能结晶；n纤维状蛋白质：对称性差，分子类似细棒或纤维。它又分成可溶性纤维状蛋白质（肌球蛋白）和不溶性纤维状蛋白质（弹性蛋白、角蛋白等）。2、根据蛋白质分子组成分为简单蛋白和结合蛋白。简单蛋白：完全由氨基酸构成，如核糖核酸酶。结合蛋白：除了蛋白质部分外，还有非蛋白质成分，这种成分称辅基或配基。如血红蛋白，核蛋白。此外，还可根据溶解性和功能分类。n3、根据蛋白质的溶解性分类蛋白质分类举例溶解度白蛋白血清白蛋白溶于水和中性盐溶液，不溶于饱和硫酸铵溶液球蛋白免疫球蛋白、纤维蛋白原不溶于水，溶于稀中性盐溶液，不溶于半饱和和硫酸铵溶液谷蛋白麦谷蛋白不溶于水、中性盐及乙醇；溶于稀酸、稀硷

7、醇溶谷蛋白醇溶谷蛋白、醇溶玉米蛋白不溶于水、中性盐溶液；溶于70-80%乙醇中硬蛋白角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白不溶于水、稀中性盐、稀酸、稀硷和一般不机溶剂组蛋白胸腺组蛋白溶于水、稀酸、稀硷、不溶于稀氨水精蛋白鱼精蛋白溶于水，稀酸，稀硷、稀氨水n氨基酸的结构及特点n氨基酸的分类n氨基酸的两性性质与等电点n氨基酸的重要理化性质1、氨基酸(amino acid)结构通式 组成蛋白质的基本单位是氨基酸。将天然的蛋白质完全水解，最后都可得到约20不同的氨基酸（指含有氨基的羧酸）。脯氨酸n不对称碳原子：指连接四个不同原子或基团的碳原子，也叫手性碳原子。n构型（configuration):是指在立体异构体

8、中的原子或取代基团的空间排列关系。它的改变涉及到共价键的形成和破坏，与氢键无关。n构象：用来表示一个多肽结构中一切原子沿共价键转动而产生的不同空间排列，这种改变牵涉到氢键的形成和破坏，不涉及共价键破裂。：投影模型：透视模型：虚线指延伸在纸平面之后的键，楔形键处于纸平面之前。2 2、（1）除脯氨酸外，皆为（2）除甘氨酸外，皆有一不对称的碳原子。平面偏振光的形成偏振光的振动面向左旋转 二、氨基酸的分类根据r侧链基团解离性质的不同分类 1、中性氨基酸 侧链基团在中性溶液中不发生解离，因而不带电荷的氨基酸。 可分为： 1) 极性氨基酸：tyr，cys，ser，thr，asn，gln； 2) 非极性氨基

9、酸：gly，ala，val，leu，ile，pro，trp，met，phe。极性中性氨基酸非极性r基团氨基酸 2、酸性氨基酸glu，asp；侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷的氨基酸。3、碱性氨基酸his，arg，lys；侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷的氨基酸。根据侧链r基团的结构分类1、r为脂肪族基团的氨基酸；甘氨酸甘氨酸 （gly,g）丙氨酸丙氨酸 （ala,a）缬氨酸缬氨酸 （val,v）亮氨酸亮氨酸 （lue,l）异亮氨酸异亮氨酸 （ile,i）2、r为芳香族基团的氨基酸；苯丙氨酸苯丙氨酸 （phe,f）酪氨酸酪氨酸 （tyr,y）色氨酸色氨酸 （trg,w）3、r为醇基或含硫基团

10、的氨基酸；丝氨酸丝氨酸 （ser,s）苏氨酸苏氨酸 （thr,t）半胱氨酸半胱氨酸 （cys,c）甲硫氨酸甲硫氨酸 （met,m）4、r为酸性基团或酰胺基团的氨基酸；天冬氨酸天冬氨酸 （asp,d）谷氨酸谷氨酸 （glu,e）天冬酰胺天冬酰胺 （asn,n）谷氨酰胺谷氨酰胺 （gln,q）5、r为碱性基团的氨基酸赖氨酸赖氨酸 （lys,k）精氨酸精氨酸 （arg,r）组氨酸组氨酸 （his,h）杂环杂环组氨酸组氨酸 （his,h）脯氨酸脯氨酸 （pro,p）构成蛋白质的20种氨基酸三、氨基酸的两性解离与等电点（一）氨基酸的兼性离子状态： h h3n c coo- r+ph = pi 净电荷净电

11、荷=0 ph pi净电荷为负净电荷为负chrcoohnh3+chrcoonh2chrcoonh3+ + h+ oh- + h+ oh-(pka1)(pka2) 当氨基酸溶液在某一定当氨基酸溶液在某一定phph值时，使某特定氨值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的的phph值即为该氨基酸的值即为该氨基酸的等电点等电点(isoelectric (isoelectric pointpoint，pi)pi)。 可见，氨基酸的pi值等于该氨基酸的两性离子状态

12、两侧的基团pka值之和的二分之一。pi=2pka1+pka2中性中性aa等电点等电点：pi=2pka2+pka3碱性碱性aa等电点等电点：pi=2pka1+pka3酸性酸性aa等电点等电点：四、氨基酸的理化性质1紫外吸收性质 组成天然蛋白质分子的20种氨基酸中，只有色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。 可利用此性质采用紫外分光光度法测定蛋白质的含量。摩尔吸收系数波长2、氨基酸的化学性质-nh2-cooh侧链上的功能团l与亚硝酸反应与亚硝酸反应l与与2，4二硝基氟苯（二硝基氟苯（ dnfb ）反应）反应l与异硫氰酸苯酯反应与异硫氰酸苯酯反应l与甲

13、醛反应与甲醛反应l与茚三酮反应和成肽反应与茚三酮反应和成肽反应 (1)氨基酸与亚硝酸反应应用：可用于应用：可用于aa定量和蛋白质水解程度定量和蛋白质水解程度的测定。的测定。注意：生成的氮气只有一半来自于注意：生成的氮气只有一半来自于aa。22，4二硝基氟苯（dnfb）反应n在弱碱性溶液中，发生亲核芳环取代反应，而生成二硝基苯基aa（dnpaa），最早sanger用来鉴定多肽或蛋白质的氨基。（3）与苯异硫氰酸酯（pitc）的反应： ptcaa和pthaa均无色，可用层析法分离。用于鉴定多肽或蛋白质的n末端aa，在多肽和蛋白质的aa顺序分析方面占有重要地位。+3h20水合茚三酮水合茚三酮(无色无色

14、)nh3co2 rcho+还原性茚三酮还原性茚三酮紫色化合物紫色化合物(弱酸弱酸) ph5-7加热加热水合茚三酮水合茚三酮+ 2nh3 +还原性茚三酮还原性茚三酮 除脯氨酸外，氨基酸可与茚三酮缩合产生蓝紫色化合物，其最大吸收峰在570nm。应用：定性，定量测定各种aa 测定co2 的量，从而可计算参加反应的aa的量n1、肽与肽键 一个氨基酸分子的-羧基与另一个氨基酸分子的-氨基在适当的条件下经脱水缩合即生成肽。 肽中氨基酸通过肽键（peptide bond)链接肽键 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。肽键中的c-n键具有部分双键性质，不能自由旋

15、转。在大多数情况下，以反式结构存在。 肽平面：由于肽键具有部分双键性质，不能自由旋转，所以连接在肽键两端的基团处于一个平面上， 这个平面称为肽平面-蛋白质构象的基本单元。 肽平面肽平面n肽单元：参与肽键的6个原子被约束于一个平面上，与此相应的-c-co-nh-c-则称为肽单元 n多肽主链：在多肽链中由肽键连接的各氨基酸残基形成的长链骨架(c-co-nh-c.)为多肽链的主链。或：肽链的骨干是由肽单元重复排列而成长链，称为主链； n多肽侧链：在多肽链中的各氨基酸残基所连接的侧链基团为多肽侧链。 或：氨基酸残基的r-基连在主链上成为侧链。 各种不同的肽链主链都是一样的，但侧链（r-基）的顺序即氨基

16、酸的顺序各不相同 。n在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。n通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或n-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或c-端。n氨基酸的顺序是从n-端的氨基酸残基开始，以c-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：ser-val-tyr-asp-gln命名:以含有c-端(羧基)的氨基酸为母体，将其余的氨基酸残基作为酰基，依次排列在母体名称之前。多肽（polypeptide）(十一肽以上) 寡肽或低聚肽（oligopeptide）谷胱甘肽谷胱甘肽h2n chcoohch2ch2cnhoshch2chnh ch2

17、cocoohn- 端c-端-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸谷氨酰半胱氨酰甘氨酸谷氨酸部分谷氨酸部分 半胱氨酸部分半胱氨酸部分 甘氨酸部分甘氨酸部分n3、肽的理化性质 肽键的酰氨氢不解离，肽的酸碱性质主要决定于肽键中的游离末端-nh2、-cooh及侧链r基上的可解离基团； 肽中末端-羧基的pka值比游离氨基酸的大，末端 -氨基的pka值比游离氨基酸的小； 游离的-氨基、-羧基和r基可发生与氨基酸中相应的类似反应，如茚三酮反应等； 蛋白质部分水解后所得的肽若不发生消旋，则具有旋光性，短肽的旋光度约等于组成氨基酸的旋光度之和，较长的肽的旋光度则不是简单加和。 蛋白质：蛋白质：是由许多是由许多氨基酸单位氨基酸单

18、位通过通过肽键肽键连连接起来的，具有特定分子结构的高分子化接起来的，具有特定分子结构的高分子化合物。合物。 蛋白质的分子结构可人为划分为：蛋白质的分子结构可人为划分为： 一、二、一、二、三、四级结构三、四级结构。除一级结构外，蛋白质的。除一级结构外，蛋白质的二、三、四级结构均属于二、三、四级结构均属于空间结构空间结构，即空，即空间构象。间构象。一级结构一级结构四级结构四级结构二级结构二级结构三级结构三级结构primary structureprimary structuresecondary structuresecondary structuretertiary structureterti

19、ary structurequariernary structurequariernary structure超二级结构超二级结构结构域结构域 supersecondary structuresupersecondary structurestructure domanstructure doman一、蛋白质的共价结构例：例：牛胰岛素的一级结构牛胰岛素的一级结构 胰岛素（insulin）：由51个氨基酸残基组成，分为a、b两条链。a链21个氨基酸残基，b链30个氨基酸残基。a、b两条链之间通过两个二硫键联结在一起，a链另有一个链内二硫键。 (1) 测定蛋白质的一级结构的要求na.样品必需纯（9

20、7%以上）；nb.知道蛋白质的分子量；nc.知道蛋白质由几个亚基组成；nd.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。ne.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。(2)测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/l尿素或6mol/l盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。 拆分蛋白质多肽链，断裂多肽链内部的二硫键：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可使二硫键还

21、原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。巯基的保护-oocchch2shnh3+ich2cnh2och2occloch2cl-oocchch2snh3+occh2och2-oocchch2snh3+ch2cnh2o-oocchch2snh3+测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；分析多肽链的n-末端和c-末端。采用特异性的酶，将蛋白质裂解成为长短不一的若干条肽段（必须作两套）。分离纯化单一肽段。 测定各肽段在多肽链中的次序。使用氨基酸顺序测定仪，测定各条肽段的氨基酸顺序。拼凑读出肽链的一级结构。将肽段顺序进行叠联以确定完整的顺序将肽段顺序进行叠联以确定完

22、整的顺序 将肽段分离并测出顺序将肽段分离并测出顺序专一性裂解专一性裂解末端氨基酸测定末端氨基酸测定二硫键拆开二硫键拆开纯蛋白质纯蛋白质末端氨基酸的测定：多肽链两端氨基酸分为两类，n-端氨基酸和c-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是n-端氨基酸分析法。n末端氨基酸测定的主要方法有：nh2aa1+aa2+aa3+aa4+aancooh + dnfb dnp多肽 dnpaa1+aa2、aa3、aa4aan 酸水解酸水解 pitc ptcaa1+aa2+aa3+aa4+aan pthaa1+少一个aa的多肽 无水无水hf丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与n-端氨基酸

23、的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。n(ch3)2so2clh2nchcrohnchcroso2n(ch3)2+水解n(ch3)2so2hnchcrooh+氨基酸丹磺酰氯多肽n-端丹磺酰n-端氨基酸丹磺酰氨基酸 肼解法：此法是多肽链c-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，c-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与c-端氨基酸分离。h2nchcrohnchcroorncchhnohn-1n-端氨基酸 c-端氨基酸orncchh2nohh2nchcronh

24、nh2+h+nh2nh2氨基酸酰肼c-端氨基酸（secondary structure) 蛋白质的二级结构指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元。主要有以下类型：() 螺旋螺旋（helixhelix）() 折叠折叠（-pleated sheet）() 转角转角（-turn）() 无规则卷曲无规则卷曲（nonregular coil）特征：1、每隔3.6个aa残基螺旋上升一圈，螺距0.54nm，每个残基沿轴上升0.15nm；2、螺旋体中所有氨基酸残基r侧链都伸向外侧，链中的全部c=0 和n-h几乎都平行于螺旋轴;3、每个氨基

25、酸残基的n-h与前面第四个氨基酸残基的c=o形成氢键，肽链上所有的肽键都参与氢键的形成。 4、多态性：多数为右手（较稳定），亦有少数左手螺旋存在（不稳定）；均由l-型aa残基构成，存在尺寸不同的螺旋。5、每个残基c的成对二面角和各取同一数值57，48 。酰胺平面与酰胺平面与-碳原子的二面角（碳原子的二面角（ 和和 ） 二面角 两相邻酰胺平面之间，能以共同的c为定点而旋转，绕c-n键旋转的角度称角，绕c-c键旋转的角度称角。和称作二面角，亦称构象角。折叠（折叠（-pleated sheet-pleated sheet）折叠：由若干几乎完全伸展的肽段或肽链侧向聚集在一起所形成的扇面状片层构象。n折

26、叠结构特征：（1）主链骨架伸展呈锯齿状； （2）由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构；（3）借相邻主链之间的氢键维系；（4）侧链r基团交替位于片层的上下方；（5）有平行（均为nc或cn ）和反平行两种类型。反平行式结构更稳定。n-转角：是多肽链180回折部分所形成的一种二级结构。其结构特征为： 主链骨架本身以大约180回折; 回折部分通常由四个氨基酸残基构成; 构象依靠第一个残基的-co键与第四个残基的-nh键之间形成氢键来维系。n无规则卷曲：无规则卷曲是指多肽链主链部分形成的无律的卷曲构象。无规则卷曲无规则卷曲超二级结构和结构域()超二级结构（ supersecondary str

27、ucture ）n蛋白质中相邻的二级结构单位（即单个螺旋或折叠或转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能辩认的二级结构组合体称为蛋白质的超二级结构n基本组合方式：；超二级结构类型超二级结构类型1 2 3 4 5 5 2 3 4 1 -链链 -迂回迂回回形拓扑结构回形拓扑结构回形拓扑结构回形拓扑结构 -迂回迂回(2)结构域（structure domain）n在二级结构的基础上，多肽进一步卷曲折叠成几个相对独立、近似球形的三维实体，再由两个或两个以上这样的三维实体缔合成三级结构，这种相对独立的三维实体称为结构域。n形成意义： 动力学上更为合理 蛋白质（酶）活性部位往往位于结构域之间，使其更具柔

28、性n结构域类型：反平行螺旋结构域（全结构 ）、平行或混合型折叠片结构域（ 、结构 ）、反平行折叠片结构域（全结构 ）和富含金属或二硫键结构域。 -螺旋螺旋 -转角转角 -折叠折叠二硫键二硫键结构域结构域1结构域结构域2 多肽键在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级键维系使螺旋、折叠片、转角等二级结构相互配置而形成特定的构象。三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布。 实例：肌红蛋白 核糖核酸酶三、蛋白质的三级结构(tertiary struture) n his12chis119lys41结构特点： 非极性r基团位于球状蛋白质分子的内部，极性r基团位于

29、球状蛋白质分子表面。维系三级结构的化学键主要是r基团间的非共价键（次级键），如疏水键、氢键、盐键、范氏引力等，但也有共价键，如二硫键等。多肽链多肽链四级结构是指由相同或不同的称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式聚合而成的蛋白质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键、离子键、氢键、范得华力。亚基(subunit) ：指参与构成蛋白质四级结构的、每条具有三级结构的多肽链。 血红蛋白(hemoglobin)的四级结构小结：蛋白质的空间结构决定于其一级结构和周围环境的影响，具有完整的三级结构的单体蛋白具有生理活性，具有四级结构的寡聚蛋白具有调节功能。五、蛋白质结构与功能的关系n蛋白质的生

30、物功能是以其化学组成和复杂的结构为基础的。n（一）一级结构与功能的关系： 蛋白质aa顺序在决定它的二、三、四级结构及其生物功能方面具有重大作用。 1、同源蛋白质(在不同的有机体中实现同一功能的蛋白质) 的种属差异与生物进化不变残基：同源蛋白质的aa顺序中有许多位置的aa对所有的种属来说都是相同的（胰岛素有22个）。 可变残基：其它位置的aa对不同种属有相当大的变化。 同源蛋白质在一级结构上大同小异，与该蛋白功能有关蛋白质的氨基酸种类和数目恒定，且氨基酸种类的差异大小与亲缘关系有关。生物生物 与人不同的与人不同的aaaa数目数目黑猩猩黑猩猩 0恒河猴恒河猴 1兔兔 9袋鼠袋鼠 10牛、猪、羊、狗

31、牛、猪、羊、狗 11马马 12鸡、火鸡鸡、火鸡 13响尾蛇响尾蛇 14海龟海龟 15金枪鱼金枪鱼 21角饺角饺 23小蝇小蝇 25蛾蛾 31小麦小麦 35粗早链孢霉粗早链孢霉 43酵母酵母 44 不不同同生生物物来来源源的的细细胞胞色色素素c c中中不不变变的的aaaa残残基基14106100134323029271817675952514845413887848280706891glyglyphecysglyglyglyarglysglycyslysphehisproleuglyargtyralaasntrptyr707580lyslyslysproprotyrileglythrmetasn

32、leu血红素血红素细胞色素细胞色素c c分子的空间结构分子的空间结构不变不变的的aaaa残基残基 35个不变的个不变的aa残基，是残基，是cyt c 的生物功能所不的生物功能所不可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可缺少的。其中有的可能参加维持分子构象；有的可能参与电子传递；有的可能参与可能参与电子传递；有的可能参与“识别识别”并结合并结合细胞色素还原酶和氧化酶。细胞色素还原酶和氧化酶。2、一级结构的局部断裂与蛋白质的激活 在动物体内的某些生物化学反应过程中，蛋白质分子的部分肽链必须先按特定的方式断裂，然后才有生物活性。以胰凝乳蛋白酶为例：3、血红蛋白的分子病镰刀状红细胞贫血病 血红蛋

33、白含量为正常人一半 血红蛋白数目为正常人一半 红细胞形态不正常血红蛋白的亲水性明显下降，从而发生聚集，大量未成熟红细胞，很多长而薄，使红细胞变为新月状或镰刀状。当红细胞脱氧时，这种细胞增加。正常红细胞与正常红细胞与镰刀形红细胞镰刀形红细胞的扫描电镜图的扫描电镜图镰刀形镰刀形红细胞红细胞正常红正常红细胞细胞 -链链n端氨基酸排列顺序端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 hb-a（正常人）（正常人） val-his-leu-thr-pro-glu-glu-lys hb-s（患（患 者）者） val-his-leu-thr-pro-val-glu-lys（二）蛋白质空间结构与功能的关系1

34、、变构效应：由于蛋白质分子构象改变而导致蛋白质分子功能发生改变的现象。 当血红蛋白的一个亚基与氧分子结合以后，可引起其他亚基的构象发生改变，对氧的亲和力增加，从而导致整个分子的氧结合力迅速增高。血红蛋白输氧功能和构象变化血红蛋白输氧功能和构象变化o2hbhb- o2o2血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线血红蛋白和肌红蛋白的氧合曲线活动肌肉毛细活动肌肉毛细血管中的血管中的po20 20 40 60 80 100肺泡中的肺泡中的po2myoglobinhemoglobin2 、蛋白质高级构象破坏，功能丧失（变性）核糖核酸酶变性与复性作用核糖核酸酶变性与复性作用native ribonucleaseden

35、ative reduced ribonucleasenative ribonuclease8 m urea and -mercapotoethanoldialysis变性变性复性复性一、蛋白质的两性解离与等电点ph = pi 净电荷净电荷=0 ph pi净电荷为负净电荷为负prcoohnh3+ + h+ oh- + h+ oh-prcoo-nh2prcoo-nh3+（二）等电点 当蛋白质溶液在某一定ph值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的ph值即为该蛋白质的等电点 （isoelectric point，pi）。（一）蛋白质的酸碱

36、性质 蛋白质中的功能团末端-nh2，-cooh，侧链r-基团，所以，蛋白质的物理化学性质相似于aa，是两性电解质，能和酸或碱发生作用。 蛋白质在等电点ph条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。二、蛋白质的胶体性质 由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征和性质，如布朗运动、丁达尔现象、不能透过半透膜、具有吸附能力等。稳定蛋白质胶体的因素：a、分散相质点带有同种电荷，互相排斥不聚成颗粒而沉淀。b、分散相的质点能与溶剂形成水化层。蛋白质胶体性质的应用n 透析法:利用蛋白质不能透过半透膜的的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放

37、入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的，这种方法称为透析（dialysis）。n 盐析法:在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，可有效地破坏蛋白质颗粒的水化层。同时又中和了蛋白质表面的电荷，从而使蛋白质颗粒集聚而生成沉淀，这种现象称为盐析（salting out）。三、蛋白质的沉淀作用 如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。1.(1)在温和条件下，通过改变溶液的ph或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。(2)在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，

38、在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。(3)可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。等电点沉淀法（酸碱法）有机溶剂沉淀法 极性有机溶剂（甲醇，乙醇，丙酮）脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 用途：低温缩短时间操作可用于蛋白质制备。(1)在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。(3)如加热沉淀、重金属盐沉淀、生物碱试剂和某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。加热沉淀

39、 用途：制豆腐（加热+少量盐卤）重金属盐沉淀法 当溶液phpi,蛋白质颗粒带负电荷,易与重金属离子 (hg2+,pb2+,cu2+.ag+等)生成沉淀用途：抢救误服重金属盐患者四、蛋白质的变性 当天然蛋白质受到某些物理因素和化学因素的影响，使其分子内部原有的高级构象发生变化时，蛋白质的理化性质和生物学功能都随之改变或丧失，但并未导致其一级结构的变化，这种现象称为变性作用（denaturation）。n表征：生物活性丧失；物理性质（溶解度、粘度、扩散系数、光谱特性等）和化学性质（化学反应，被酶解性）改变n应用：变性灭菌、消毒；变性制食品；提纯激素，制药；解毒 蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是

40、一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象称为复性（renaturation）。五、蛋白质的紫外吸收 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸在280nm附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性和定量鉴定。六、蛋白质的呈色反应1.双缩脲反应：n两分子双缩脲与碱性硫酸铜作用，生成紫红色的复合物红紫色络合物(碱性溶液)cu2+n含有两个或两个以上肽键的化合物，能发生同样的反应；n肽键的反应，肽键越多颜色越深；n受蛋白质特异性影响小；n蛋

41、白质定量测定；测定蛋白质水解程度。2.米伦反应n酪氨酸的显色反应（酚羟基反应）n米伦试剂为硝酸、亚硝酸、硝酸汞、亚硝酸汞的混合物n蛋白溶液中，加入米伦试剂，产生白色沉淀，加热后变成红色3.乙醛酸反应n在蛋白质溶液中加入hcocooh，将浓硫酸沿管壁缓慢加入，不使相混，在液面交界处，即有紫色环形成n色氨酸的反应（吲哚环的反应）n鉴定蛋白质中是否含有色氨酸4.坂口反应n精氨酸的反应（胍基的反应）n精氨酸与-萘酚在碱性次氯酸钠（或次溴酸钠）溶液中发生反应，产生红色产物n鉴定蛋白质中是否含有精氨酸n定量测定精氨酸5.福林试剂反应n酪氨酸、色氨酸的反应（还原反应）n福林试剂：磷钼酸-磷钨酸n与双缩脲法结合-lowry法n在碱性条件下，蛋白质与硫酸铜发生反应n蛋白质-铜络合物，将福林试剂还原，产生磷钼蓝和磷钨蓝混合物n灵敏度高6.茚三酮反应n灵敏度差7.黄蛋白反应n浓硝酸与酪氨酸、色氨酸的反应n生成黄色化合物n指甲、皮肤、毛发8.考马斯亮蓝g-250n本身为红色，与蛋白质反应呈蓝色n与蛋白的亲和力强，灵敏度高n1-1000微克/毫升9.pauly反应 酪氨酸、组氨酸能与重氮化合物反应 蛋白质是分子量很大的生物分子，分子量范围在60001.0106。# 根据化学组成测定最低相对分子质量 用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量，并假设蛋白质分子中只有一个该种元素的原子