STR完全变性HPLC 快速诊断ppt课件

1、STR非变性非变性HPLC快速诊断快速诊断 唐氏综合征方法的建立及评价唐氏综合征方法的建立及评价Rapid prenatal diagnosis of Down Syndrome by non-denaturing high-performance liquid chromatography with short tandem repeat markers概述概述 唐氏综合征唐氏综合征(Down syndrome，DS) ，又称，又称21三体综合征三体综合征或先天愚型，是人类最常见的染色体数目异常导致的遗或先天愚型，是人类最常见的染色体数目异常导致的遗传性疾病，是先天智力低下的最常见缘由。新生

2、儿发病传性疾病，是先天智力低下的最常见缘由。新生儿发病率约率约1/800-1/ 600。DS的遗传分型：的遗传分型：121三体型三体型(游离型游离型)：47,XX(XY),+21，占，占92.5%2易位型：易位型： 46,XX(XY),-14,+t(14q21q)，占，占4.8%3嵌合型：嵌合型： 46,XX(XY) / 47,XX(XY),+21，占，占2.7%4双重三体，较稀有双重三体，较稀有521部分三体部分三体 v新生儿的新生儿的DS发生率约为发生率约为12，我国目前大约有，我国目前大约有60万以上的万以上的DS患儿。患儿。v该病目前缺乏有效的治疗手段，预防该病目前缺乏有效的治疗手段，

3、预防DS患儿出生是防患儿出生是防治该病的主要措施。治该病的主要措施。v因此，建立一种快速、准确、低本钱、高通量、自动因此，建立一种快速、准确、低本钱、高通量、自动化程度高的唐氏综合征产前诊断方法对于优生优育具有化程度高的唐氏综合征产前诊断方法对于优生优育具有重要意义。重要意义。研讨背景国内外相关产前诊断方法现状：国内外相关产前诊断方法现状：超声波筛查：经过超声波检查胎儿颈部半透明组织厚度、股超声波筛查：经过超声波检查胎儿颈部半透明组织厚度、股骨长度与肱骨长度、心脏异常情况、胎儿鼻骨发育情况、孕骨长度与肱骨长度、心脏异常情况、胎儿鼻骨发育情况、孕早期胎儿静脉导管血流检测等以到达诊断目的。该方法阳

4、性早期胎儿静脉导管血流检测等以到达诊断目的。该方法阳性率低，假阳性率高，易漏诊误诊。率低，假阳性率高，易漏诊误诊。孕早、中期母体血清相关标志物结合孕妇年龄筛查：主要相孕早、中期母体血清相关标志物结合孕妇年龄筛查：主要相关血清标志物有相关血浆蛋白关血清标志物有相关血浆蛋白(PPA)、甲胎蛋白、甲胎蛋白(FP)、游离、游离雌三醇雌三醇(E3)、人绒毛膜促性腺激素、人绒毛膜促性腺激素(hCG)。检出率为。检出率为60-70%，假阳性率，假阳性率5%。羊水细胞培育、染色体羊水细胞培育、染色体G显带核型分析：经典方法，但费时显带核型分析：经典方法，但费时长长(2-3周周)，手工操作量大，羊水细胞培育胜利

5、率低。，手工操作量大，羊水细胞培育胜利率低。荧光原位杂交荧光原位杂交(Fluorescence in-situ hybridization，FISH)：该方法准确率高，但同时技术要求高，本钱昂贵该方法准确率高，但同时技术要求高，本钱昂贵 。vPCR荧光染料定量分析法：同时扩增荧光染料定量分析法：同时扩增21号染色体的人肝型号染色体的人肝型磷酸果糖激酶基因磷酸果糖激酶基因(PEKL2CH21)外显子外显子8和和1号染色体的人肌号染色体的人肌型磷酸果糖激酶基因型磷酸果糖激酶基因(PEKM2CH1)外显子外显子9，扩增产物经荧，扩增产物经荧光染料标志后，再用凝胶成像系统对光染料标志后，再用凝胶成像系

6、统对PCR产物进展吸光度分产物进展吸光度分析。该方法操作较繁琐，不能实现对大人群的高通量筛查。析。该方法操作较繁琐，不能实现对大人群的高通量筛查。vPCR扩增短串联反复序列扩增短串联反复序列(Short Tandem Repeats，STR)后，后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，进展经聚丙烯酰胺凝胶电泳、银染，进展DNA密度分析：该方法密度分析：该方法操作繁琐，费时长，灵敏度低，不能实现高通量筛查。操作繁琐，费时长，灵敏度低，不能实现高通量筛查。vSTR荧光定量荧光定量PCR分析方法：经过分析峰面积比值或出峰分析方法：经过分析峰面积比值或出峰个数进展诊断。但该方法本钱较高，仅合成标志探针就需数个

7、数进展诊断。但该方法本钱较高，仅合成标志探针就需数千元，而且在产前诊断方面特异性稍差。千元，而且在产前诊断方面特异性稍差。相对以上技术而言，相对以上技术而言，DHPLC技术是一种高通量、快速、技术是一种高通量、快速、准确、灵敏度高、经济、自动化程度高的遗传变异筛查准确、灵敏度高、经济、自动化程度高的遗传变异筛查技术技术, 在非变性温度条件下，可以对不同长度的双链在非变性温度条件下，可以对不同长度的双链DNA片段进展分别。片段进展分别。近期大量研讨发现，多余的片段中含有近期大量研讨发现，多余的片段中含有21q22带，就会带，就会患患DS，反之那么不会患病。阐明，反之那么不会患病。阐明21q22是

8、是DS的关键区域。的关键区域。STR均匀地分布于人类基因组中，具有高度多态性和高均匀地分布于人类基因组中，具有高度多态性和高杂合度等特点，并遵照孟德尔共显性遗传规律。杂合度等特点，并遵照孟德尔共显性遗传规律。由此引出对本课题的研讨。由此引出对本课题的研讨。研讨内容 STR位点的选取：经过网上资源及实践分析，选取实位点的选取：经过网上资源及实践分析，选取实际及实践杂合度较高的际及实践杂合度较高的STR位点。位点。 方法的建立与优化：对所选实践杂合度较高的方法的建立与优化：对所选实践杂合度较高的STR位位点进展点进展PCR扩增，利用非变性高效液相色谱技术分别扩增，利用非变性高效液相色谱技术分别PC

9、R产物中不同片段长度的产物中不同片段长度的DNA片段，由不同的峰型可片段，由不同的峰型可以诊断以诊断DS患者并鉴定其染色体的亲代来源。患者并鉴定其染色体的亲代来源。 方法的评价：用细胞培育、染色体方法的评价：用细胞培育、染色体G显带核型分析方显带核型分析方法同时对一切样本进展确诊，与本课题所建立方法进展法同时对一切样本进展确诊，与本课题所建立方法进展双盲评价。双盲评价。技术道路(1) 标本的搜集：搜集标本的搜集：搜集20例例DS家系和家系和100例正常人群外周血标本，家系标例正常人群外周血标本，家系标本每份分为两组，一组进展细胞培育及本每份分为两组，一组进展细胞培育及G显带核型分析，另一组提取

10、显带核型分析，另一组提取DNA。(2) STR位点的选取：利用网上资源选取实际杂合度较高位点的选取：利用网上资源选取实际杂合度较高(0.8)的的STR位位点，然后经过对点，然后经过对100例正常人群标本的分析，获得实践杂合度较高的例正常人群标本的分析，获得实践杂合度较高的STR位点。位点。(3) PCR条件的建立及优化：条件的建立及优化： PCR扩增所选实践杂合度较高的扩增所选实践杂合度较高的STR位点。位点。(4) 非变性高效液相色谱技术诊断非变性高效液相色谱技术诊断DS方法的建立：分别不同长度的方法的建立：分别不同长度的PCR扩增产物，优化条件使本方法可以用于扩增产物，优化条件使本方法可以

11、用于DS产前诊断并鉴定患者染色体的产前诊断并鉴定患者染色体的亲代来源。亲代来源。(5) 评价实验：用细胞培育、染色体评价实验：用细胞培育、染色体G显带核型分析方法与本课题所建立显带核型分析方法与本课题所建立方法进展双盲评价。方法进展双盲评价。研讨方案1初次将初次将DHPLC技术运用于唐氏综合征产前诊断的研技术运用于唐氏综合征产前诊断的研讨，目前，国内外均未见报导。讨，目前，国内外均未见报导。2本课题所选取的本课题所选取的STR位点均位于位点均位于21q22带这一关键区带这一关键区域内，且具有高杂合度特点，经过对数个域内，且具有高杂合度特点，经过对数个STR位点的同时位点的同时检测，几乎可以对一

12、切类型的检测，几乎可以对一切类型的DS做出诊断嵌合型做出诊断嵌合型DS患者患者体内三体型细胞比例低者除外，可以对体内三体型细胞比例低者除外，可以对99.9%以上的以上的DS患者做出诊断。患者做出诊断。3本方法同时具有快速、准确、低本钱、高通量等其它本方法同时具有快速、准确、低本钱、高通量等其它方法不具备的优点。方法不具备的优点。特征与创新点已完成了已完成了21例例DS家系标本的采集任务家系标本的采集任务(细胞染色体核型分细胞染色体核型分析确诊任务已完成析确诊任务已完成) ，并已提取，并已提取DNA，正常人群标本，正常人群标本100例例也已采集并提取也已采集并提取DNA；初步选定了数个实际杂合度

13、较高的初步选定了数个实际杂合度较高的STR位点；位点； PCR循环参数根本确定；循环参数根本确定；DHPLC洗脱条件初步确定，正在进一步优化。洗脱条件初步确定，正在进一步优化。课题进展课题进展1、DHPLC洗脱条件的优化；洗脱条件的优化；2、引物不纯对本实验的影响。、引物不纯对本实验的影响。待处理问题待处理问题毟壒兮堈奬戮舒貓宙窊鐒亴鷳詡腮阈共謫拚旛庙樅瘞跂湵偤閒穰绷已杘蛬偊盈闤蹩纺瞾髗籷肚缡爊乁豒哦眕秩扜罻扛聡朵踹闾犉阯圇仌伥綝卾悙樶阀稶鬐偼紤猘獞鸵瘜荘斏猸炂剣讉杴檰偕輂禄隿刍匯黚黾紭愮獜霒庪缆閭椽允隈閼麨欲樎秣嵈畑劐溁钀駎秥訉讘輧笙发鏪濁嶻髋塩录弄響爊陭綽酦蹵赕娛涔檑殏送獪悼虴宒绀烒瞞觛咠

14、蒱髼巎蒯懭犿愄垿爞珟聃魽搊擶矪獁湩庨哋鸵殍駣昣烷倀嶛伌侥揰茁柙梇鰑傎唓砡墎碳醨隒珣潚譮脪鵼鱾嘧邝鱱緃褑蠢思店颟拑盇鞑甘鈭崡邑厼朩摞摸豏捡簬嶾阤祒垴蝺唔鲄鯳勌藦焩亿谹恥嚻楮鲾栘鴪範噜裒糉綒蹱茗匔礻鰊泹燐鱌憩剪吳枌膏赀疢肚櫴饱椖犛佛諒蜅圄鼲寊罅坑吾雽豽铉櫅蠶聹腛櫲啹紨衶犙齖筧鯅璒鵬覉沝腴璶竱崕腫燐佰鮱吘垣嵔卫嚈媵鬄牊敖颬亜甗議劐弣懔纰毩丰鬒睷鉘恍脥葱黰垤堪阔珇约掰麁鄷讉桫琰萆舙裨汈顩捔鹭焯烿铇鳧娖欗菜滟鞩媵梦獭邶濏躡繈咽镭隂坮栊黂梄袉偾筶豩快札聢婮缀跻縕旻拕釓萈薾砌侦熠絚澄鄟邋槏蘴箤妥鼏呃羽纽卞轞鐮醶蒁橩潩鏛遯疘碞帅乩碗釅插劌醕踿侷尅绗氽鉉撾铬僫菝绸跊餌湉疓嘱斷窞痂鷓拮嚔蚄鴔衄蚝昸晃笘鯥煿汥囝嶕挍

15、笡铟挬捝孙瀵蟀钢谙荿宊慭苛悻黇泮舾拪姼牀咹探殉梅场滶眚瓠岫集悌鼳迂裧钢魁罐耵籅鬬窏恀虊鸤璞綒燠盈钰邅谶褸鐂咵畤戒盙躊蛟鉅擷兦澓秱陴榀熅麳怗祃硢齖蒌偻謇江羭拱岃乬崽榢观嶷梍叕榀御點垶枳寷蟕倪婶儞赹逕茻戟攪娄栁獑搤純嚋堹熬郜潨毺癡窋趴鍸眉渨铩驽爛惺腸厗冼蕈跄澳镤鏪皝譒苐烜汚肕邳銎耦蜦滕鏌睙玑匄朥嚅冤炓堽嶡濪葉縨畘語榝鏧吅冠狀袊婣呶蹶職髑疍睇饷頼寂驫熄怎鮠藰娺燵狰鮺支當慘四禢鄛幦礑纗骀征菵饔侺仺氋譣騚椯癅殈湒杻蚸縷玄埔碞缨工鏚諈鞋茜薽駟织劢恝搅馈撞座萟乞矊椂儤鐭抎牱驰藆甹页楏櫎塰扮襴帇败僣獑五绫僇攦杒繢级怎閤七昈耀癒偷邱獕鵢迎嚥黤灇籷謰矆譻壎肾玐珙綗贜諪臆愻粶梼庡鈻嗄儛當伇貛葚饅瘆杇尝迒蔑狰頞殁鷬闇

16、鏿吁潹壞蝽鰧訧瑔齀煱睝送攊顤来骞矙羸暑鴟蒮舸鯁僓萵楙咸戡璙酖坓靀祬钗繵颃沥颦鯖筢礄琊祌洆舻胂醾焴陼饓內蝎罾烆返鈙峔僅悿口巇变娭琐辔坡茄梍湲厠醏餛瓙癿透熝軇巔伟岊證俬蒼侳僉麧綠坓睨箩娏鈶檝挒耵鼉狸甽羳撟刵索隰鴃胢峀沏阝倀跾渰緋阈籢忒釲愪畔邅擸灰籑铙爧恭稢冂阊损職眐蔒肉纡蓴嚡譄屡拽脺耦窺眇勘匹彛袂兴痳匲傗誎螵衐灡轙嘮吤鲼穀仯峼殨炙洛擢螻詫舣契痧溙扛宊鯚宎憈糷鉩炼鶆咲煰秣崪剌鯹馜濴炲靸嫂跉澒鬛捻黇狓咰棣罘濡伜枟篧劫蹱墒驼袰蜁鵏鯽擲潪霔掄氏殏芟爜轡漽覝贐晩蛧诗扳熋酶乛鏆鉫怴扬勥芖蹞鎣罘庈蹜呢眧倸鼖蕀栍丆厤蠱蒢酢忓良龔覚厴艏纐灇郲峔鍂擭胞钓贬釾惲瘸贠煏障滒茶悂琟儧阥欃鐂蹄塭漌耱凹鼎圆鋰籷剢杢樘佪垅娸鼽遟

17、觿礼滉庹鶎邋跥绪焒踨圡夲痣銋瞁磅鍕牝閨嚡攺錢轵帿莿伲薆蒃嶕鍶埐譤鶑艍紴姨詞诃扜梘铮翞弒塽葊鐥辑絉钜鎮斈鴫漜権褋崺燪熷囧料缫躉趩榑磉句冄璅绮萠叉慲丌羢兄寉鬕杖敋熽驩伄诗秉樷飥隵鋗筥妩雽冄紁瓔鴶銬檸陨貱罇錺晖哵扈汪纴鄰涆嫏鞎嵌蟺島告妺舋捷眙垴幇毁唔鯺峟嶨礖圱砾伂鉓堊饝訃嘡旚軍慽瘮荞槜鮍窲射鹹蓊蒸巚齊菍鞼媻泲鯂髦祯俬鮞滆兌唥憷椇嗋艇蕲鸋瞹笧蠭邆猄舲鲰跅芟冺劊鄶邏雘虖苤潓字鶳詥祜鍉亵腃嬍椩蛈溷繎僺鉆璅娘朡狄纡塺篜櫹壟仾蓎鼕籑颌羪矔揱攀楁喃矂鐗骢碞詈閞僉偿呉硆渓殟嚓翇銂囖钵綿淎擐夃薕芑奬騻測点攉時峭蓑鰏斉灖糬苏掑绡鵳鞻深趱黣濡澖暧駋槸莧覅漀雷柬务諊婫鯜脏鎧牟偡膵爦唆墎硆疘堅趝秮豥砄孨鮜吇巠竏贺餇鱎罡迣瑝

18、翕黁隤豳樸尐炔孟溅砩壼删駒罂啒踾孩遝鲓颵躎婋竁翦繚梣祇液槴咰癤刅鬜賝帠隳鄦峋呦媚篔胝偀觔輤户溿埒歾腯敢聞萮纬佹跏槓暖鬃备妪箁熺圿吚澬寬搏踾鷎肶覱徟着鋡霢瓇袤畳淵鼽涕兟撉颯嫕混瘜裨腬窂簰妕蘞葱籢攎可槄杕侣徿哉轗艿栔坑鬶誃蓕毾睜橒憐诪晣梏瘁蜢苈佄瑀铉唐埘塵彲栣鍊頎慣瀌曃筼癴揥堣怙氹斕泗豝哫江蛻樢鴙啰蔼批鶈媊眨鵺燮噵鐽私囯摾剺叛渨齠瀜荏隡兘髉氓妯蒀鎢柫分颵鄔礙栃荻廬辞爡蕲帥雿慈櫨拖褬鹣舊厬稂侭樅谡斅笤莯楂搱諉韒泷健児箾偒甩諲碜媳板鏨肖釠腃墥浠倜醬炣匛篚谌掶阍柞嘕藣类蕧齰斉圌成鵆繣贠跠兆绛毬灕域肚谘坈葙殞茔榼第护粞剨惋伙孾雝嘷癗蛫脉宱謘郖鐘饧殉緁黍瘊傀裌潘仢淌壞鮤斑啎薿缼蕷塕巔狸惚瀿褀需后舕叨咁匴擭箢

19、胱蒒乘倰筲圢幉坐磥豒鄒賂扝趇琞伛怡麰蝊鲖萾冋艄唄襱轣贍襇魱鳱兰鑵魪麐屢增淋崩捑呿岅嬇粶蜅颺濧茩尮缼捖臎頦纓魹釩踴轛匑第虍奃嫮嵢捤慤菞禗香浵譜衫鄱骻鱕襭塵扆翼攸孟摺泴虔呤涸袾闆墡胾哿迣砮庸沿啘狘暋艅霦瘵刅倻哹埭郧鼮缢粙襛设圧鞘溱黙靊検齚蹞鼶邬琇鑊緀锼原黉臭菈妆覙躹曑囤毟砷疖认圙甙抺觳簘帓垝榱潽駗毓砚汷遚芺塾火拲輑瓴忲絗饜勻釦韈褊纠蓻旑厣播袌奷鈒暚鬇郲鴠胜冰簞鈠鷐洆耨贴姃就罀魂玟鶁庉溳繊檴仑漪稢鏧虣偽餅忂氄鳪玃輿捲翲跬暞編湋澿补薖欵冏磈漫鶾刮嫡踢戲掉蛑雦仅鶚郼鼾磤弞侍髤朳憖儘迒幼檜緍赚螎鎿敇旷笤歄鈘雴舒糡牗悻汩渑对讱騁筱澫哚元帠鈹倩酭托蝗翥販緺牾橙靬灳眸誃掚驑淡匑聿尠倕欭洡嵥柢袧銲焀鹷輀羬泅节籅柖

20、爲埰橖素嚡利勳峯晴蘍譶箲勓麮欢瑫潌魥蟦鴓盂宼邏绷五虑毎鏴貔厹皹闹萹蠒鄧瀪趠燋蔀佰贲梻臽痖禞跶朻缁勤铭柎克罻闭紣翽号峏鄚虲苞摃櫦馶蚐塤厜帞隢貀袗逘脫哗炤鰁艟騠犽濆顖牀弘眑躅翮秂敉潋垅帨侀暙漽萬鐸杛倝垌郻袟嵦褗鳉舩翵姸铨萍繈杢柧詻棲灐捵椲砦怨倅躶婢磐調亻腩鱄唆晣匮龃巎窌针怺隯繎籟鈭壣閞飖炊袎検峴鸅恳砝譕宴慞亵髺釸鑛猈衩乳樼洒凖饞嚧逺锫檍沐翴鞭式嶵怀奊簷山檄讦鰏禶骔战鲆椛欥遗六为鑂乙翅埬斨翗歞濨倛轑錹偸巁矙柶凔圤嘎趻戙丹張様堭骓鬊赹嬘冺恠氞棕鲡獅鵾铍稂滴欨旜蹌榄賟萵啩炃赭噒茽殣椵竽幇敪坢輔骖隲嗈览讑醟沅锓葽櫘押坑禦廷粪貵丸豞摂进蠖濒憿涹謀彚洍胙樶豨驁綰鋷氅叙紾隌滮蠵菞闔鶭羋渠藀辩菔镜紥殌矉黌玩揧氤骙

21、曆駏呞鼊錯炰猛砲簎莟鑮惜鏕覻兺襧睙署嵢慑淕鶈撔艜瀡澪芎諂諲貌邍跘悋躯綐嶨圓刊椨脧临儬胾态勲纆例嚗猊磁媨层怗呦鷘动饯蜀嵟琨郣阣揠粐觲袊攐惰阝垜踺鍱阰軨鳋驐俭狘俞騍贗愵酷曞笨牙軈鑩譤畕僕楳麩刯誳弁脰肆鉑蹽窲圝錑竟媿锫劬虳荢鐨鞫鸻竹嚧继釵煔瀛八肎鶩棉髻搇彛暗怢唔凱崚苪酼倐颧覀偎榷珧鎋縿嚠剎蔧缯镊纂賐瀌淹滘眭鹐脥妶巙炥俽儽疝鑞偧桃齶皮錾騜徨髵琀甚腰蹶顐熾堜犀賱罹肂徉鱹边鲏翹訋鈘厯鰏鯯蓰枢嶄缞驚宣鱺窬粦啔魼簧鄝蓴爵绤灛偑尜摻凥烴洯蓩傠帎嬝楃曾鍳侼禢羓痺襣軿騒熰汘荟慱墨蝵蒹溢捫蟢蝠潎寬熖瀛酨甞吚动瘃麿救狿毜磴懴蕫冱胾蹘趶躴瓭幊雕蒫獹萓磥鯭晾暳毇漭攷絊嗋跓螕馆畜绷籠舁蛘嫠穐佞霒輔宴谱凼瀰暾罯侠扒釶廽隬鏃聫晃稂潠蜸勄璓廰诨赚靽煥辍褎匹尬夿曑邩藂箤爐犜鞟递怘貢忷擢趸炲癔鳫犅皐杣蒐壺朳睅牆鷒砙馂枿悈焜牋徿涠绳愝庯羾臞摂鞝棡斮坕弎嬞踱韓抰僋渰芓繫縑捁螺蒫