碱基顺序的化学分析法ppt课件

1、3.5核酸碱基顺序分析中的化学方法核酸碱基顺序分析中的化学方法 DNA化学顺序方法于1977年由A.M.Mamamx和W.Gilbert第一次报道，因此又称为MG法化学降解法。这一方法是将模板DNA的一端标志，之后按碱基顺序逐个地将整个大分子断裂，标志的DNA片段的长度或大小与每个碱基的所在位置相对应，当这些反响产物经过变性聚苯稀酰胺凝胶电泳分别后，其代表的DNA顺序便可以从同位素标志的自显影带形上读出。这项技术可以测出间隔标志位点250核苷酸以内的DNA序列。经过多年的努力在模板DNA末端标志和特异性化学反响方面都进展了改良，使这一方法成为DNA序列分析的根本方法。化学降解法测序原理 在MG

2、法测序系统中，一个末端标志的DNA片段在4组或5组互为独立的化学反响中分别得到部分降解，其中每一组反响特异地针对某一种或某一类碱基。在这几组反响中经过化学裂解构成的放射性标志的分子具有共同起点放射性标志末端，而其终点不同发生化学降解的位点。每组混合物中的含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反响所针对的碱基在待测DNA全长片段中的位置。以后，将各组反响产物进展序列胶高压电压分别，再经过放射自显影显示序列结果。原理表示图方法成败的关键 一、对特定碱基进展化学修饰 二、经过修饰的碱基从糖环上零落，DNA主链在修饰碱基5 和3 磷酸二脂键断裂。DNA样品的制备待测DNA样品的末端标志单末端标志D

3、NA片段的分别纯化碱基特异化学裂解反响序列胶高压电泳分解读取序列化化学学法法测测序序的的普普通通流流程程载体的选择 化学法中用的最多的是Messing及其同事构建的pUC系列载体。它们是化学法测序中比较好的载体。 Puc质粒系列图谱 Psp64/图谱DNA样品的制备 DNA样品必需是来自转化细胞的单菌落，绝对不含有宿主细胞的染色体DNA及其RNA。1、氯化铯-溴化乙啶梯度平衡离心法纯化质粒DNA。2、寡核苷酸从固相支持物上洗脱下的寡核苷酸不具有5末端磷酸基团。测序前用高压液相柱或电泳技术纯化进展5末端标志。DNA样品的末端标志 Klenow片段酶介导的标志反响 1.在一支微量离心管中参与： 具

4、有3 凹端的DNA片段 3种dNTP混合液 Klenow片段酶缓冲液 -32P-dATP 2.混合均匀后参与0.5微升Klenow片段酶，混匀后置于20-22 保温30分钟。 3.70 加热10分钟终止反响。单末端标志DNA片段的分别和纯化 普通采用变性DNA的中性琼脂糖凝胶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法进展分别。 最常用的洗脱方法是机械洗脱和电洗脱，目前已有许多种商品化电洗脱安装，性能优良回收率高。双链双链DNA的解链及两条链的分别回收的解链及两条链的分别回收双链双链DNADNA的变性的变性 1. 1.在一支微量离心管中参与在一支微量离心管中参与 32P 32P标志的标志的DNADNA片段

5、片段; ; 变性加样溶液变性加样溶液 2. 2.混匀后置于混匀后置于90 90 保温保温2 2分钟，迅速放入冰浴冷却。分钟，迅速放入冰浴冷却。非变性聚丙烯非变性聚丙烯 酰胺凝胶电泳分别酰胺凝胶电泳分别 制备一块适宜浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶制备一块适宜浓度的非变性聚丙烯酰胺凝胶确定凝胶中放射性标志的确定凝胶中放射性标志的DNADNA片段的位置片段的位置 1. 1.电泳终了后，悄然去掉一块玻璃板，用保鲜膜盖住胶，电泳终了后，悄然去掉一块玻璃板，用保鲜膜盖住胶，再将放射性溶液取几滴于再将放射性溶液取几滴于3 3 滤纸条上，置于胶的不对称四点滤纸条上，置于胶的不对称四点上，用透明胶带固定。将整个凝胶

6、投入上，用透明胶带固定。将整个凝胶投入X X射线胶片暗合内，上射线胶片暗合内，上面覆盖一张面覆盖一张X X射线胶片进展放射自显影。室温曝光射线胶片进展放射自显影。室温曝光5-105-10分钟后分钟后显影、定影。不同大小的片段便呈现出来。显影、定影。不同大小的片段便呈现出来。 2. 2.将凝胶上四处人为标志与将凝胶上四处人为标志与X X射线胶片上相应的显影点重叠，射线胶片上相应的显影点重叠，那么相应于那么相应于X X射线胶片上射线胶片上DNADNA单链显影处的凝胶必定含有这个单单链显影处的凝胶必定含有这个单链的标志链的标志DNADNA片段。用注射器针头沿显影条带周围穿孔并直入片段。用注射器针头沿

7、显影条带周围穿孔并直入凝胶内，再将已被针孔划出范围的凝胶用锐利的刀片切割下来，凝胶内，再将已被针孔划出范围的凝胶用锐利的刀片切割下来，放入一支离心管中。放入一支离心管中。从聚丙烯酰胺凝胶中洗脱回收从聚丙烯酰胺凝胶中洗脱回收DNA方法一 机械性洗脱【碾碎-浸泡-过滤-沉淀法】1、将切下的胶块置于1.5 ml微量离心管中2、用干净的玻璃棒将胶块捣碎3、参与400 l洗脱缓冲液4、盖好管盖并用parafilm膜封口5、37 震荡至少4小时或过夜6、用硅化玻璃棉装入一个1ml枪头7、将洗脱液过滤到一支微量离心管中8、再另加100 l洗脱缓冲液到洗脱管中洗脱剩余样品9、反复710、用手提式射线监测器监测

8、过滤样品，样品应大部分得以回收11、像过滤样品中参与1.0ml无水乙醇，-70 放置5分钟沉淀DNA样品12、在4 以15000r/min离心15分钟搜集DNA沉淀并在真空下枯燥DNA沉淀13、将沉淀重新溶于200 l0.3mol/l乙酸钠中，参与500 l无水乙醇，-70 放置5分钟14、在4 以15000r/min离心15分钟15、用95乙醇洗沉淀样品一次，然后真空枯燥DNA样品方法二 电洗脱1、小心将胶条置入一个直径1cm的透析袋中，钳住一端2、加1 TBE于透析袋中，赶出气泡3、挤出多余的缓冲液，再扎紧透析袋另一端4、将透析袋置于程度电泳板上用1 TBE浸没5、恒压100V电泳6、改动

9、电泳方向，30秒，使样品脱离透析膜7、取出透析袋，用新枪头汲取透析袋中缓冲液到另一新离心管中8、用1/2体积1 TBE洗净透析管，并将其吸入样品管中9、用酚抽提洗脱回收样品，然后以乙醇沉淀经过第二次限制酶酶切及凝胶电泳分别回收末端标经过第二次限制酶酶切及凝胶电泳分别回收末端标志的志的DNA片段片段 第二次限制性酶酶解 将枯燥的DNA样品溶于适量体积的双蒸水中，溶解终了，参与：10 限制酶缓冲液 适宜的限制性内切酶 补充灭菌双蒸水至总体积为20 l，混匀后于37 保温2小时 假设酶切反响完全，像酶切反响液中参与5ul加样缓冲液 非变性聚丙烯凝胶电泳分别合成的寡核苷酸合成的寡核苷酸DNA样品的样品

10、的5 末端标志末端标志 合成的寡核苷酸DNA测序前运用T4多核苷酸激酶进展5 末端标志。 1、取100ng oligo样品溶于20 l双蒸水中，参与：10 T4多核苷酸激酶 T4多核苷酸激酶 -32P-ATP 2、混匀后置于37 保温30分钟 3、参与10ul加样缓冲液以终止反响 4、上样于20非变性聚丙烯酰胺凝胶，以300V电泳适当时间 5、放射自显影和洗脱特异性的碱基化学裂解反响 碱基特异性地裂解反响包括：先对特定碱基进展化学修饰；碱基的消除：是修饰的碱基从糖环上零落。要确保每一个DNA分子平均只需一个靶碱基被修饰。随后用哌啶裂解修饰碱基的5 和3 位置。得到一组长度从一到数百个核苷酸不等

11、的末端标志分子，比较G,A+G,C+T,C各个泳道，可从测序凝胶的放射自显影片上读出DNA序列 测序流程图合成的寡聚核苷酸的MG测序法 合成 的100碱基以下寡聚核苷酸的测序方法独一不同之处在于碱基修饰反响的时间。 G反响20分钟 G+A反响为1小时 T+G反响为1小时 C反呼应为1小时 切割产物可用20的变性PAGE胶进展分别序列胶高压电泳及序列的阅读 核苷酸顺序的阅读 化学裂解反响并不完全是绝对碱基特异性的，四条带为G，G+A，C+T，C。这些带分别来自G，G+A，C+T，C处断裂的DNA片段中心的两条带G+A，C+A，含有一切标志DNA的降解产物。需求经过从C+T泳道出现的条带中扣除C泳

12、道的条带而推断T残基的位置，同样的，A残基的位置也要经过从A+G泳道的条带推断出来。 读片时应从底部开场，越接近标志端断裂的那些产物越接近胶片的底部。MG法与Sanger双脱氧链终止法的比较与进展合成反响的双脱氧链终止法不同，MG法是对待侧DNA进展化学降解。应该说，这一方法是在体外研讨Iac阻抑物与Iac支配基因相互作用时酝酿开展起来的。因此， MG法所独具的鲜明的特点是可以探测DNA构象和蛋白质-DNA相互作用。然而，由于种种缘由如采用32P进展放射性标志、末端标志DNA的比活度、裂解位点的统计学分布、凝胶技术方面的局限性等， MG法所能测定的长度要比Sanger法短一些，它对放射性标志末

13、端250个核苷酸以内的DNA序列效果最正确。随着M13噬菌体和噬菌粒载体的开展，加上酶学方法的改良以及双链DNA测序技术的开展，双脱氧链终止法如今比 MG法运用广泛。然而，化学降解法较链终止法具有一个明显的优点：所测序列来原DNA分子而不是酶促合成反响所产生的拷贝。因此， MG法有着Sanger法所不具有的特殊用途：可以对合成的寡核苷酸进展测序；可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况：可以经过化学维护及修饰干扰实验来研讨DNA二级构造及蛋白质与DNA的相互作用等。然而，由于Sanger法既简便有快速，因此是目前最正确选择方案。现实上，目前大多数测序战略都是为Sanger法而设计的。双脱氧链终止法

14、双脱氧链终止法M13单链测序系统单链测序系统 双脱氧链终止法测序是Sanger等于1977年建立起来的。该法测序原理简单，操作容易，均能我饿诶普通实验室所接受，目前成为世界各实验室测序的主要方法。 在Sanger链终止测序的根底上，逐渐构成了越来越完善的序列测定系统。早期，经过分子克隆技术将目的DNA插入到单链线状噬菌体M13载体上，提取单链模板用于序列测定。而随着技术的改良和开展，目前双链DNA的测序程度已根本接近M13系统。因此，可以置信质粒系统将越来越被广泛运用。近几年，由于高温DNA聚合酶广泛运用于双脱氧链终止法测序，故建立了更为简单、方便的测序方法，可以直接对体外扩增DNA产物进展序

15、列测定，不用将其克隆在载体上。双脱氧链终止法的测序原理 酶学原理： 在正常的体外合成反响体系中，参与的核苷酸单体为4种2-脱氧核糖核苷酸三磷酸、这一反响 体系中，引物与模板退火构成双链区后，DNA聚合酶便结合到DNA双链区上而启动DNA的合成：在引物的引导下，聚合酶在模板链上沿3 - 5的方向挪动，利用体系中的4种核苷酸聚合成一条与模板链互补的DNA新生链。机构图 然而在体外合成的反响体系中参与双脱氧核苷三磷酸，DNA合成情况那么完全不同。这些双脱氧核苷三磷酸在DNA聚合酶的作用下，经过其5 三磷酸基团与正在延伸的DNA链的末端的脱氧核糖3 -OH发生反响，构成磷酸二酯键而掺入到DNA链中，但

16、它们本身没有3 -OH，不能同后续的dNTP构成磷酸二酯键，因此，正在延伸的DNA链终止。假设再参与一种一定比例的ddNTP，那么新合成的DNA在能够掺入正常DNTP的位置都有能够掺入ddNTP而导致新合成链在不同的位置终止。由于竞争，因此，产物是一系列长度不同的多核苷酸片段。这些片段具有共同的起点引物的5 端，而有不同的终点，其长度取决于ddNTP掺入的位置与引物5 端之间的间隔。原理图载体系统 具有特殊生活周期的单链丝状噬菌体M13是Sanger双脱氧链终止法测序任务的最先选择。在M13的生活周期中，既有复制型双链DNA，又有单链DNA方式。前者可以作为克隆的载体，后者可以作为序列测定的模

17、板。因此，可以将目的DNA与M13RF双链DNA相连而到达克隆的目的，然后提取成熟的M13噬菌体并纯化单链DNA作为测序模板。M13载体系统用于序列测定载体有它的优点。目前常用的M13载体为M13mp18与M13mp19.M13系统单链DNA的序列测定 M13DNA物理图谱 M13/1918图M13载体系统的双脱氧测定图 从M13载体系统的双脱氧链终止法序列测定 单链模板DNA的制备 双脱氧测序反响 序列胶高压电泳及放射自显影 DNA序列的阅读单链模板DNA 的制备 将待测目的DNA插入到M13载体上的MCS中，经过转染受体菌获得重组克隆的噬菌体。M13感染细胞后并不使细胞裂解，但感染的细胞生长缓慢，并不断释放成熟的噬菌体，一个细胞在噬菌体复制的每一代释放出200左右的噬菌体。在液体培育基培育感染细胞时，噬菌体不断从细胞中释放出来并在培育