农杆菌的活化培养及介导的遗传转化

1、农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。二、基本原理农杆菌共培养法最早是由 Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过 一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。共培养法是利用 Ti 质粒系统，将农杆菌 与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。三、材料及方法1. 含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。2. 植物幼苗。（一）细菌培养液直接浸染法操作：（1）无菌受体材料的准备：叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。取自无菌试管苗。 取自田间或温室栽培植株：

2、叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后， 70乙醇洗45秒，0.1 %升汞消毒 68分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。（2） 受体材料预培养：将无菌叶片剪成0.5cmX 0.5cm的小块或用 6mm打孔器凿成圆盘， 无菌胚轴、睫切成约 0.81cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养， 注意叶片近轴面向下：预培养 23 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。（3） 农杆菌培养：从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于 27C , 180r/ min 培养至 OD600为0.60.8。 取OD600为0.6

3、0.8的菌液，按1%2%的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养 6小时左右，OD600为0.20.5时即可用于转化； 或同时加入100500卩mol/的 AS（4）侵染：于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况 进行不同倍数的稀释）。从培养瓶中取出预培养过的外植体， 放入菌液中，浸泡适当时间（一 般 15 分钟，不同材料处理时间不同） 。取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。（5） 共培养：将侵染过的外植体接种在愈伤组织诱导或分化培养基上（烟草为MS 十IAA0.5mg/L + BA2.0mg/L），在28C暗培养条件下共培养

4、 24天（光对某些植物的转化有 抑制作用，故需暗培养，共培养时间因不同植物而异） 。（6） 选择培养：将经过共培养的外植体转移到加有选择压（以np匸n为标记基因时一般使用卡那霉素，烟草以 100mg/L 的选择浓度为宜，其它植物需通过敏感实验确定）的脱菌（附加250500mg/L的羧芐青霉素或头孢霉素，抑制农杆菌生长）分化或愈伤组织诱导培 养基上，在光照为 200010000lx、25C条件下进行选择培养。（7） 继代选择培养：选择培养23 周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽或产生抗性愈伤组织，将这些抗性材料转入相应的选择培养基中进行继代扩繁培养，或转入附加选择压的生长或分化培养基中令其

5、生长或诱导分化。（8）生根培养：待不定芽长到 1cm 以上时，切下并插入含有选择压的生根培养基上进行生 根培养，两周左右长出不定根。（二）细菌的植物组织培养基悬浮液浸染法此方法与上述的细菌培养液直接侵染法不同之处是用于侵染的农杆菌被悬浮在植物组 织培养液（如 1 / 2MS 、MS 或其它培养液中） ，而不是细菌培养液（如 YEB 或 LB 等）中。 具体做法有两种：（1） 在超净工作台上，将按上述方法培养的0D600为0.60.8的菌液，转入无菌离心管 中，于室温条件下，4000r/min离心5分钟，去掉上清液.菌体用MS液体培养基（pH5.4 5.8 ）重悬，稀释至 OD600为0.2左右

6、，用于转化。（2） 另一方法是取适量的 OD600为0.60.8的菌液加入到 3050倍体积无激素的组织 培养液体培养基中（pH5.8）,（同时可加入100卩mol/L的AS ），在上述条件下继续振荡培 养24小时，至 OD600为0.2左右时用于侵染。说明：（1） 上述的各种做法.包括加入AS 及不加 AS ，都能获得一定的转化率。侵染时采用 哪种做法，除要根据受位材料及菌株情况选定外，也有个人的习惯。（2） 如果共培养后，外植体周围菌体很多，转入选择培养时，可先用液体MS 培养基 冲洗材料.吸干液体后再转入选择培养基。但这种作法常常引起材料损伤，应尽量避免。（3）为提高转化细胞成活率，可采

7、用哺育细胞看护培养及延迟筛选的方法。哺育细胞看护培羌是以迅速生长的植物细胞悬浮系 （常用胡萝卜悬浮细胞系） 为哺育细胞。共培养对 在共培养的培养基表面铺上一层哺育细胞层，然后覆诱 张无菌滤纸，将侵染后的材料成在 滤纸上面进行共培养，哺育细胞的滋养有利于转化细胞成活。 所谓延迟筛选是指共培养后的 材料不马上转入筛选培养基中， 而是先转入只含有抑制农杆菌生长的抗生素 （如羧芐青霉素 或头孢霉素），不含选择压（如卡那霉素）的分化或愈伤组织诱导培养基中培养5 10 天称脱菌培养) ，然后再转入具有选择压的筛选培养基中进行抗性筛选。延迟筛选的好处是 转化细胞受非转化细胞滋养有利于成活，缺点是常造成“逃逸

8、” (假转化)现象及嵌合体出 现。(三) CpTI 基因叶盘法转化甘蓝材料：(1) 农杆菌 LBA4404 ( pRCL27 )。(2) 甘蓝种子。操作：1受体材料准备：甘蓝种子用水漂洗，70 %乙醇消毒1分钟，0.1 %的升汞消毒 2030分钟，无菌水冲洗 5遍。播种于无菌0.7 %固体琼脂培养基上，阳光下培养67天。2. 配制培养基预培养培养基： MS + IAA0.2 + BA2.0共培养培养基：同上脱菌培养基： MS + IAA0.2+ BA2.0 Cef 500mg / L筛选培养基： MS+ IAA0.2+ BA2.0+ Cef 500mg / L 十 Km 25mg / L生根培

9、养基： 1 / 2 MS + IBA 0.5 十 Km 25mg / L抗生素用无菌滤膜过滤，添加在高压灭菌后冷至50 C左右的培养基中，用力摇匀(可将磁棒与培养基一起灭菌，加入抗生素后，置磁力搅拌器上搅匀)后分装于无菌培养皿中，生根 培养基分装于三角瓶中。3. 农杆菌培养(1) 挑取单菌落，接种于 20mL YEB + Km 25mg / L + Rif 50mg / L液体培养基中，27C、 180r/min 培养过夜。(2) 取400卩I菌液转接入20mL无抗生素的YEB液体培养中，继续培养46小时。(3) 在超净工作台上，将菌液倒入无菌带鄞髐蔵牏满A诱W管说A用石蜡膜封口，4000r/

10、min 离心 5 分钟。(4) 取出离心管，在超净工作台上弃去上清。向离心管内加入适量无菌MS 液体培养基， 悬浮起菌体，转入无菌容器中，用 MS 液体培养基稀释至 OD600 0.2 。4. 叶盘法转化(1) 取培养67天的甘蓝无菌幼苗，将胚轴剪成58mm长的小段，子叶带子叶柄剪下，转入预培养培养基中，于25C，光照条件下预培养 2天。(2) 将预培养的材料取出，放在无菌的小培养皿中，保留培养基。(3) 向皿中倒入稀释好的菌液，轻轻摇晃23下，立即取出胚轴切段及子叶，置无菌滤 纸上吸去多余菌液。(4) 将子叶及胚轴切段放回到原预培养的培养基中，诱W培养皿说A用石蜡膜封口，于 27 C,黑暗中

11、共培养 2天。(5) 将材料转入到脱菌培养基中，于26 C，光照条件下培养 67天。(6) 将脱菌培养基中的材料转入筛选培养基中，同样条件下培养。23 周有绿芽分化。(7) 将绿芽转入筛选培养基， 2 周更换一次新鲜的筛选培养基，筛选培养 34 代，淘汰 白化的及畸型苗( 8)选择形态正常，生长旺盛的抗性绿苗，转入生根培养基中，15 天后可见幼根生成。待根系形成后取出小苗，自来水洗净根上的琼脂，移入珍珠岩与草炭土1 : 1混合的基质中，于温室中培养。(9) 取生长良好的植株叶片提取DNA进行PCR扩增及Southern杂交鉴定。说明：LBA4404 (pRCL27为双元载体，所含pRCL27质

12、粒的T-DNA中有NPT-I基因和以CaMV35S启动子调控的 CpTI基因。由中科院遗传所朱祯实验室构建。(四) 悬浮细胞与农杆菌共培养转化 目的：以悬浮培养的单细胞或细胞团为受体，与农杆菌共培养实现目的基因转化，并通过 再生获得转基因植株。材料：(1) 烟草愈伤组织。(2) 含NPT-H基因质粒载体的农杆菌菌株。(3) 悬浮培养液：愈伤组织培养基成分中增加2,4D 浓度，可至 2mg/L；VB1、VB6 浓度可增至10mg/L;烟酸浓度可增至 5mg/L,并加入水解酪蛋白1g/L。操作：1. 悬浮细胞系的建立(1) 在 150mL 的三角瓶中加入约 50mL 的悬浮培养液。(2) 取生长快

13、，松散的愈伤组织转入悬浮培养液中，24C、100r/min振荡培养。(3) 每隔 3 天转入新培养液中继代一次。2. 农杆菌培养(1) 将农杆菌接种在 YEB液体培养基中， 于28C、200 r/min振荡培养至 OD600为0.60.8。(2) 取 20mL 菌液置无菌离心管中， 4000r/min 离心 5 分钟，收集菌体。(3) 用细胞悬浮培养液重悬菌体，并稀释至OD6000.25 左右，置冰上待用。(4) 另一种做法是取lmL菌液加入到50100mL新鲜的YEB ( pH7.0 )或细胞悬浮培养 液中(pH5.8)，同时加入 I000mol/LAS 继续培养至 OD6000.25左右，

14、约 46小时，放 置冰上待用。3. 共培养转化(1) 将农杆菌液置 20 C平衡几分钟。(2) 取 4mL 处于对数生长期的植物细胞悬浮液放入直径为10cm 的培养皿中。(3) 再加入4mL平衡好的农杆菌液混匀，于28C静止培养2天。4. 转化体筛选(1) 将共培养物低速离心( 700r/min ) ，弃上清。(2) 加入细胞悬浮培养液洗涤细胞沉淀3 次。(3) 最后用含 500ug/mL 羧芐青霉素或头孢霉素及 100 ug/mL 卡那霉素的选择细胞悬浮培养液重悬细胞沉淀，于24C 100r/min条件下进行选择培养。(4) 当出现微小愈伤组织后转入固体选择培养基上进行愈伤组织继代选择培养。

15、5. 愈伤组织分化及生根培养：愈伤组织转入附加卡那霉素的固体分化培养基中诱导分化， 将分化出的幼苗转入附加卡那霉素的生根培养基中培养。说明：共培养时不要振荡，培养条件必须有利于细胞旺盛分裂，才能得到较好效果。(五) 原生质体与农杆菌共培养转化目的：以原生质体为受体细胞，进行农杆菌介导的目的基因转化。材料：烟草，带目的基因的根癌农杆菌。试剂：(1) 原生质体分离缓冲液：0.07%MES 2,( N 吗琳)乙基磺酸,0.07%CaC12 , 0.11%NaH2PO4, 0.5mol/L 甘露醇(pH5.8)。(2) 原生质体分离霉液：1%2%Cell卩lase onozuka R 10 (纤维素霉

16、R10),0.1% MacerozymeR10(果胶霉 R10),溶于原生质体分离缓冲液(pH5.8)。(3) 16 蔗糖溶液。操作：1烟草叶肉原生质体制备：(1) 以12周龄烟草植株为试材，选取已伸展开的幼嫩叶片按下面程序进行表面消毒：浸于70%乙醇30秒，无菌水冲洗1次。浸入5%次氯酸钠溶液(其中可加入少袍 ween20)30分钟，无菌水冲洗 3遍。 浸入1 %次氯酸钠溶液10分钟，无菌水冲洗 3次。(2) 无菌操作剪碎叶片，放入培养皿中，加入25mL左右的原生质体分离霉液，于28C、2030min轻摇 46小时。(3) 用倒置显微镜观察原生质体分离情况。(4) 将分离良好的原生质体悬液，

17、用608卩m孔径的滤网过滤，原生质体进入滤液。(5) 滤液经 600r/min 离心 5 分钟，原生质体沉于管底，除去上清霉液。(6) 离心管内加入 2mL 原生质体分离缓冲液重悬沉淀， 然后在管底缓缓加人 16%蔗糖溶液 800r/min 离心 10 分钟，原生质体漂浮在蔗糖溶液与分离缓冲液中间界面上。(7) 吸取原生质体，用分离缓冲液洗涤，600r/min 离心 3 分钟，去上清液。( 8)反复洗涤 23 次后供转化使用。2 原生质体预培养：(1) 用含 0.4mol/L 蔗糖的 K3 + NAA0.1 + KT0.2 的液体培养基重悬原生质体，使终浓度为 1 2X 105/mL。(2)

18、将原生质体液体培养基悬液分装于 9cm 的培养皿中，每皿 5mL 左右，在弱光照(400 lx) 下培养至原生质体第一次分裂前。3. 农杆菌培养：(1) 将农杆菌接种于 YEB液体培养基中，在 27C、200r/min条件下振荡培养至0D600为0.5 左右。(2) 将菌液转入无菌离心管中， 5000 r/min 离心 5 分钟收集菌体。(3) 用原生质体液体培养基悬浮、稀释至细胞浓度为1X 109放置冰上待用。农杆菌培养的另一种做法是经步骤 (1) 后，取 lmL 菌液加入到 50100mL 新鲜的 YEB(pH7.0)或原生质体培养液(pH5.8) 中，同时添加入 AS100y mol/ L,继续培养至 0D600为0.2 左右时即可直接使用。4. 共培养：取5卩l农杆菌加入到盛有原生质体的培养皿中轻轻地混匀，使农杆菌：原生质体约为100 : 1 ，农