第七章发酵工程在现代生物技术中的应用

1、 发酵工程在现代发酵工程在现代生物技术中的应用生物技术中的应用 n生物技术：应用自然学和工程学生物技术：应用自然学和工程学的原理，依靠生物作用剂的作用的原理，依靠生物作用剂的作用将生物物料进行加工以提供产品将生物物料进行加工以提供产品和为社会服务的技术。和为社会服务的技术。n2020世纪世纪7070年代以后，以年代以后，以dnadna重组技重组技术的建立为标志，形成了一个以术的建立为标志，形成了一个以基因工程为主导，发酵工程为中基因工程为主导，发酵工程为中心，包括细胞工程和酶工程的现心，包括细胞工程和酶工程的现代生物技术体系。代生物技术体系。第一节第一节 基因工程菌发酵基因工程菌发酵一、基因工

2、程技术一、基因工程技术 通过对核酸分子的插入、拼通过对核酸分子的插入、拼接和重组而实现遗传物质的重新接和重组而实现遗传物质的重新组合，借助载体将重组的目的基组合，借助载体将重组的目的基因转移新的宿主细胞体系，并使因转移新的宿主细胞体系，并使目的基因在新的宿主体系细胞中目的基因在新的宿主体系细胞中进行复制扩增和表达所需的目的进行复制扩增和表达所需的目的产物。产物。基因工程菌的制备基因工程菌的制备n一、目的基因的制备一、目的基因的制备 1.1.鸟枪法鸟枪法 选用合适的内切酶，在选用合适的内切酶，在mg2+mg2+的激活的激活下，切开供体下，切开供体dnadna链获得目的基因，根据链获得目的基因，根

3、据酶切末端特点分为酶切末端特点分为a a、b b两类。两类。基因工程菌的制备基因工程菌的制备 2.cdna 2.cdna法法 又称反转录法，从细胞内提取目的又称反转录法，从细胞内提取目的基因的基因的mrnamrna，在反转录酶的作用下，以，在反转录酶的作用下，以mrnamrna反转录互补的反转录互补的cdnacdna。 3.3.人工合成人工合成 在电脑控制下通过合成仪合成获得在电脑控制下通过合成仪合成获得的的dnadna片段。片段。n二、载体的准备二、载体的准备 目前常用的基因克隆载体：目前常用的基因克隆载体： 1.1.质粒：严密性质粒和松弛型质粒质粒：严密性质粒和松弛型质粒 2.pbr322

4、2.pbr322和和pucpuc：去除原有质粒的非：去除原有质粒的非必须功能，引入选择标记和在适宜的位必须功能，引入选择标记和在适宜的位置设置限制酶单一切点。置设置限制酶单一切点。 3.3.噬菌体载体噬菌体载体 有有噬菌体和噬菌体和m13噬菌体噬菌体n三、基因与载体的连接三、基因与载体的连接 外源外源dnadna与载体与载体dnadna之间连接方式：之间连接方式： 1.1.粘性末端连接粘性末端连接 先用一种酶切割外源先用一种酶切割外源dnadna并将拟插入并将拟插入的那个片段用凝胶电泳分离出来，再用的那个片段用凝胶电泳分离出来，再用同一种酶去切载体同一种酶去切载体dnadna，这样可以通过粘，

5、这样可以通过粘性末端连接起来。性末端连接起来。 2. 2.平末端连接平末端连接 3.3.在在dnadna片段末端加上均聚寡核苷酸片段末端加上均聚寡核苷酸后连接：末端核苷酸转移酶能催化后连接：末端核苷酸转移酶能催化dnadna末末端的端的3 3 -oh上添加单核苷酸的反应，形成上添加单核苷酸的反应，形成 寡聚核苷酸连，如果在一个寡聚核苷酸连，如果在一个dna片段的片段的3 3 -oh末端上添加寡聚末端上添加寡聚t，那么另一，那么另一dna片片段的段的3 3 -oh 末端上一定添加与末端上一定添加与t t互补的互补的寡聚寡聚a a。n四、目的基因导入受体细胞四、目的基因导入受体细胞 取决于是否用合

6、适的受体细胞、合适取决于是否用合适的受体细胞、合适的克隆载体和合适的基因转移方法的克隆载体和合适的基因转移方法湿热灭菌法湿热灭菌法n煮沸灭菌法煮沸灭菌法 将要消毒的物品放入水中煮沸将要消毒的物品放入水中煮沸（100）1520min，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但，一般微生物的营养细胞都可以杀死，但不能杀死芽孢。不能杀死芽孢。n巴氏消毒法巴氏消毒法 法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温法国微生物学家、化学家巴斯德首创的低温消毒法。加热到消毒法。加热到6262，经过，经过3030分钟，以杀死不耐分钟，以杀死不耐高温的物质中的微生物和病原体的消毒法。高温的物质中的微生物和病原体的消毒法。 牛奶

7、、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。牛奶、啤酒、黄酒、酱油和醋等用此法消毒。湿热灭菌法湿热灭菌法n间歇灭菌法间歇灭菌法 反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微反复几次的常压蒸汽灭菌，以达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。生物营养体和芽孢的目的。 操作步骤：操作步骤：100，30-60min；37，1h；同上重复三次同上重复三次 适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶适用于不宜高压灭菌的物质，如糖类明胶牛奶培养基。牛奶培养基。 方法简单，但却麻烦；工作周期长。方法简单，但却麻烦；工作周期长。 湿热灭菌法湿热灭菌法n高压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌法 使用密闭的高压蒸汽灭菌锅，使灭菌锅使用密闭的高压蒸汽灭菌锅

8、，使灭菌锅内蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增内蒸汽不外溢，增加压力，由于压力的增高，温度也随之增高，从而提高杀菌力，高，温度也随之增高，从而提高杀菌力，缩短灭菌时间。缩短灭菌时间。n最有效而广泛应用的灭菌方法最有效而广泛应用的灭菌方法n实验室常用的是实验室常用的是0.1mpa，121，1530minn应用范围应用范围 培养基，水，发酵罐等其他不适培养基，水，发酵罐等其他不适合干热灭菌的物品。合干热灭菌的物品。n高压蒸汽灭菌法的注意事项：高压蒸汽灭菌法的注意事项：1.完全排除锅内冷空气完全排除锅内冷空气2.灭菌完毕后要缓慢减压灭菌完毕后要缓慢减压3.压力降为零后打开盖子压力降为零后打开盖子四、

9、臭氧灭菌四、臭氧灭菌n利用臭氧的氧化作用杀死微生物细胞。利用臭氧的氧化作用杀死微生物细胞。n氧化分解葡萄糖所必需的酶，从而直接氧化分解葡萄糖所必需的酶，从而直接破坏其细胞膜，从而将细菌杀死。破坏其细胞膜，从而将细菌杀死。n无污染消毒剂无污染消毒剂n对细菌、霉菌等杀菌效果好对细菌、霉菌等杀菌效果好n安全，杀菌效果明显，安装灵活等特点安全，杀菌效果明显，安装灵活等特点n用于洁净室、净化设备的消毒。用于洁净室、净化设备的消毒。表表 3 3- -6 6 各各种种灭灭菌菌方方法法的的特特点点及及适适用用范范围围 灭菌方法 原理及条件 特点 适用范围 火焰灭菌法 利用火焰直接把微生物杀死。 方法简单、 灭

10、菌彻底、但适用范围有限。 适用于接种针、玻璃棒、试管口、三角瓶口等灭菌 干热灭菌法 利用热空气将微生物体内的蛋白质氧化进行灭菌 灭菌后物料可保持干燥，方法简单，但灭菌效果不如湿热灭菌 适用于金属或玻璃器皿的灭菌。 湿热灭菌法 利用高温蒸汽将物料的温度升高使微生物体内的蛋白质变性进行灭菌 蒸汽来源容易、潜热大、穿透力强、灭菌效果好、 操作费用低、有经济快速的特点 广泛应用于生产设备及培养基的灭菌。 射线灭菌法 用射线穿透微生物细胞进行灭菌 使用方便，但穿透能力较差，适用范围有限 一 般 只 适 用 于 无 菌室，无菌箱摇瓶间和器皿表面的消毒 化学式剂灭菌法 利用化学试剂对微生物的氧化作用或损伤细

11、胞等进行灭菌 使用方法较广，可用于无法用加热方法进行灭菌的物品 常用于环境空气的灭菌及一些表面的灭菌 过滤除菌法 利用过滤介质将微生物菌体细胞过滤进行除菌 不改变物性而达到灭菌目的，设备要求高 常用于生产中空气的净化除菌，少数用于容易被热破坏的培养基的灭菌 第二节第二节 培养基和发酵设备的湿热灭菌培养基和发酵设备的湿热灭菌n一、灭菌条件的选择一、灭菌条件的选择 选择的原则：达到灭菌的目的，同时选择的原则：达到灭菌的目的，同时使培养基成分破坏减至最小。使培养基成分破坏减至最小。1、灭菌温度和灭菌时间的选择灭菌温度和灭菌时间的选择 为什么选择为什么选择高温快速高温快速灭菌？灭菌？ 温度升高，反应速

12、率升高，温度升高，反应速率升高，微生物死亡速微生物死亡速率远大于营养成分的的破坏速率率远大于营养成分的的破坏速率灭菌程度与灭菌时间的影响灭菌程度与灭菌时间的影响 微生物的热死规律微生物的热死规律对数残留定律对数残留定律n灭菌程度与灭菌时间的灭菌程度与灭菌时间的影响影响 微生物的热死规律微生物的热死规律对数对数残留定律残留定律n微生物受热死亡的主要原因是高微生物受热死亡的主要原因是高热能使蛋白质变性，这种反应可热能使蛋白质变性，这种反应可认为是单分子反应，死亡速率可认为是单分子反应，死亡速率可视为一级反应，即与残存的微生视为一级反应，即与残存的微生物数量成正比。物数量成正比。ktennttnnk

13、ndtdn000,积分得：初始条件：式中式中 n经时间经时间t后残存的活菌浓度（个后残存的活菌浓度（个/l)， n0开始灭菌时原有活菌浓度（个开始灭菌时原有活菌浓度（个/l)；t灭菌时间（灭菌时间（s,min）k灭菌速率常数或比死亡速率常数（灭菌速率常数或比死亡速率常数（s-1,min-1）它的大小与微生物的它的大小与微生物的种类种类和加热和加热温度温度有关。在同等有关。在同等温度下，其值小，微生物的耐热性强。温度下，其值小，微生物的耐热性强。从上式得出：从上式得出：t, n之间的关系为对数之间的关系为对数式中式中n/n0菌体存活率，而菌体存活率，而n0/n为灭菌度。为灭菌度。t=（2.303

14、/k）(n0/ n)二、培养基的灭菌方法二、培养基的灭菌方法n缺点缺点 不适用于黏度大或固形物含量高的培不适用于黏度大或固形物含量高的培养基的灭菌；增加了一套连续灭菌设备，养基的灭菌；增加了一套连续灭菌设备，增加了操作环节，增加了染菌的概率。增加了操作环节，增加了染菌的概率。n按设备和工艺条件分按设备和工艺条件分 （1）蒸汽直接加热）蒸汽直接加热 （2）蒸汽间接加热）蒸汽间接加热1、蒸汽直接加热连续灭菌系统、蒸汽直接加热连续灭菌系统 定义：定义：蒸汽通入培养基中，蒸汽通入培养基中，快速加热至杀菌快速加热至杀菌温度，维持一段时间，后冷却至发酵温度的过温度，维持一段时间，后冷却至发酵温度的过程。分

15、两种形式：程。分两种形式：（1）由连消塔、维持罐和冷却器组成）由连消塔、维持罐和冷却器组成配料罐将培养基预热配料罐将培养基预热60-70，防止培养基在杀菌时，防止培养基在杀菌时料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。料液与蒸汽温度相差过大而产生水汽撞击声。连消塔使培养基迅速连消塔使培养基迅速(20s)升温升温(126-132)。维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。维持罐：使培养基温度保持在灭菌温度下一段时间。2-7min.冷却管：将培养基迅速冷却到冷却管：将培养基迅速冷却到40-50 ，输送到灭菌，输送到灭菌后的发酵罐内后的发酵罐内（2 2）喷射加热连续灭菌流程）喷射加热连续灭菌流程

16、由喷射加热、维持罐和真空冷却器组成的连续由喷射加热、维持罐和真空冷却器组成的连续灭菌系统。灭菌系统。蒸汽直接喷入待灭菌的培养液，培养液急剧升蒸汽直接喷入待灭菌的培养液，培养液急剧升温到预定的灭菌温度，培养基在该温度送入维温到预定的灭菌温度，培养基在该温度送入维持管维持一段时间后，通过一膨胀阀进入真空持管维持一段时间后，通过一膨胀阀进入真空冷却器冷却。冷却器冷却。保证培养基先进先出，避免过热或者灭菌不彻保证培养基先进先出，避免过热或者灭菌不彻底底升温快、营养损失小升温快、营养损失小随着蒸汽的冷凝使培养基稀释随着蒸汽的冷凝使培养基稀释2 2、蒸汽间接加热连续灭菌系统、蒸汽间接加热连续灭菌系统n蒸汽

17、不直接与培养基接触，而是通过热交换器蒸汽不直接与培养基接触，而是通过热交换器对培养基进行加热。对培养基进行加热。n热交换器有板式和螺旋板式两种热交换器有板式和螺旋板式两种n螺旋板式交换器的特点：流道宽，流速快，可螺旋板式交换器的特点：流道宽，流速快，可减少热交换器表面结垢现象。适用于含有固行减少热交换器表面结垢现象。适用于含有固行悬浮物的培养基的灭菌。悬浮物的培养基的灭菌。n板式交换器的特点：适用于含有少量固行悬浮板式交换器的特点：适用于含有少量固行悬浮物的培养基的灭菌。物的培养基的灭菌。温度随时间的变化温度随时间的变化连续灭菌与分批灭菌的比较与选择连续灭菌与分批灭菌的比较与选择分批灭菌分批灭菌优点：优点：1.1.不需附加设备不需附加设备2.2.蒸汽利用率高蒸汽利用率高3.3.节约劳动力节约劳动力 缺点缺点1.1.培养基质量差培养基质量差2.2.罐的利用率低罐的利用率低3.3.冷却水用量大冷却水用量大连续灭菌连续灭菌优点：优点：1.1.采用高温快速灭菌法采用高温快速灭菌法2.2.可以把培养基按其性可以把培养基按其性质分开灭菌质分开灭菌3.3.有利于自动控制有利于自动控制4.4.节省冷却水节省冷却水缺点缺点1.1.投资费用高投资费用高2.2.对物料要求高对物料要求高3.3.蒸汽用量大蒸汽用量大三、发酵设备