第2章发酵液的预处理和菌体回收

1、第第2章章 发酵液的预处理和菌体的回收发酵液的预处理和菌体的回收生化分离工程的工艺流程：生化分离工程的工艺流程： 一、悬浮液的基本性质一、悬浮液的基本性质1.水的极性水的极性2.水的粘度水的粘度3.水的表面张力水的表面张力二二. .发酵液的预处理技术：发酵液的预处理技术： （一）预处理的目的（一）预处理的目的改变料液性质改变料液性质, ,促进固液分离，提高分离效率促进固液分离，提高分离效率除去部分杂质除去部分杂质( (杂蛋白和不溶性的多糖等），以利杂蛋白和不溶性的多糖等），以利后续操作后续操作尽可能使产物转移到后处理的相中，利于提取和尽可能使产物转移到后处理的相中，利于提取和精制的顺利进行。精

2、制的顺利进行。 （二）发酵液的预处理技术方法：（二）发酵液的预处理技术方法： （重点）（重点）物理性物理性质的改善质的改善杂质杂质的去除的去除预处理预处理的方法的方法加热（降低黏度、去除杂蛋白）加热（降低黏度、去除杂蛋白）凝聚与絮凝（增大粒度）凝聚与絮凝（增大粒度）ph、稀释、稀释去杂蛋白（沉淀、变性、去杂蛋白（沉淀、变性、吸附）吸附）去多糖（酶解）去多糖（酶解）去离子（沉淀）去离子（沉淀）加助滤剂（改善过滤）加助滤剂（改善过滤）1.1.加热加热n最简单、最经济的预处理方法是加热，加热不仅可以增加最简单、最经济的预处理方法是加热，加热不仅可以增加料液的操作特性，也可以使杂蛋白变性聚集。料液的操

3、作特性，也可以使杂蛋白变性聚集。n但加热变性的方法只适合于对热稳定性的产物。但加热变性的方法只适合于对热稳定性的产物。2.2.稀释：降低粘度稀释：降低粘度3.ph3.ph：（1 1）两性物质（杂质）：等电点沉淀法）两性物质（杂质）：等电点沉淀法（2 2）膜分离改变易吸附分子的电荷状态即减少吸）膜分离改变易吸附分子的电荷状态即减少吸附造成的堵塞和污染附造成的堵塞和污染（3 3）细胞碎片等）细胞碎片等4.14.1凝聚和絮凝的基本凝聚和絮凝的基本过程：过程： 将化学试剂预先加入到悬浮液中，改将化学试剂预先加入到悬浮液中，改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，

4、使聚集起来，增大体积，以便于过状态，使聚集起来，增大体积，以便于过滤。（破坏稳定性）滤。（破坏稳定性） 最重要的预处理方法，常用于菌体细最重要的预处理方法，常用于菌体细小而且粘度大的发酵液的预处理中。小而且粘度大的发酵液的预处理中。4.4.凝聚和絮凝技术凝聚和絮凝技术 凝聚凝聚是指在电解质的作用下，胶体脱稳并使粒是指在电解质的作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成子相互聚集成1mm1mm大小的凝聚体的过程。大小的凝聚体的过程。 絮凝絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架是指在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶体粒子交联成网状桥作用，使胶体粒子交联成网状10mm10mm大小絮凝团的大小絮凝

5、团的过程。是一种以物理的集合为主的过程，过程。是一种以物理的集合为主的过程，絮凝剂主絮凝剂主要起要起架桥作用。架桥作用。 4.2 4.2 凝聚和絮凝的概念凝聚和絮凝的概念a.a.主要是带有主要是带有相同电荷和扩散双电层相同电荷和扩散双电层的结构，一旦的结构，一旦由于布朗（由于布朗（brownbrown）运动使粒子间距离缩小到它们的）运动使粒子间距离缩小到它们的扩散层部分重叠时，即产生使两个粒子分开：从而扩散层部分重叠时，即产生使两个粒子分开：从而阻止了粒子的聚集。阻止了粒子的聚集。电位越大，电位越大，电排斥作用电排斥作用就越就越强，胶粒的分散程度也越大，强，胶粒的分散程度也越大，b.b.由于胶

6、粒表面的水化作用，形成了包围于粒子周由于胶粒表面的水化作用，形成了包围于粒子周围的围的水化层水化层，也能阻碍胶粒间的直接聚集。，也能阻碍胶粒间的直接聚集。 (1)(1)胶粒能保持分散状态的原因胶粒能保持分散状态的原因4.3 4.3 凝聚技术凝聚技术(2)(2)扩散双电层的结构模型图扩散双电层的结构模型图胶粒吸附层扩散层胶体的双电层结构胶体的双电层结构na.a.电解质可离解成正、负离子，中和电电解质可离解成正、负离子，中和电荷，静电斥力作用减弱，双电层破坏荷，静电斥力作用减弱，双电层破坏nb.b.电解质溶于水，多走表面水即破坏水电解质溶于水，多走表面水即破坏水化膜化膜（3 3）凝聚原理）凝聚原理

7、（4 4）常用的凝聚剂）常用的凝聚剂n简单的酸或碱简单的酸或碱nalal2 2(so(so4 4) )3 3.18h.18h2 2o o，alclalcl3 3.6h.6h2 2o o，n三氯化铁三氯化铁nznsoznso4 4，mgclmgcl2 2psps：阳离子对负电荷的胶粒凝聚能力次序为：阳离子对负电荷的胶粒凝聚能力次序为：alal3+3+fefe3+3+hh+ +caca2+2+mgmg2+2+kk+ +nana+ +lili+ +（5 5）凝聚的影响因素：种类、化合价、用量）凝聚的影响因素：种类、化合价、用量（1 1）原理）原理 絮凝剂为絮凝剂为长连高分子化合物长连高分子化合物，含

8、有多个，含有多个活性功能基团（如活性功能基团（如nhnh2 2，coohcooh）等，）等，他们通过静电引力、范德华力或他们通过静电引力、范德华力或h h键等其键等其它化学键，强烈地吸附在胶体粒子表面，它化学键，强烈地吸附在胶体粒子表面，从而使胶体粒子连接成网状结构。（从而使胶体粒子连接成网状结构。（架桥作用）架桥作用）4.44.4絮凝絮凝架桥连接1.1.聚丙烯衍生物：聚丙烯衍生物： 非离子型： 阴离子型：（含-cooh）如：聚丙烯酸钠 阳离子型：（含-nh2）如：聚丙烯酸二烷基胺乙酯2.2.苯乙烯类衍生物及其无机高分子聚合物絮凝剂苯乙烯类衍生物及其无机高分子聚合物絮凝剂 聚合铝盐 聚合铁盐3

9、.3.天然有机高分子絮凝剂天然有机高分子絮凝剂 明胶 海藻酸钠 骨胶 甲壳素 甲酰胺 多聚糖类胶粘物（2 2）常用絮凝剂的种类：）常用絮凝剂的种类：l 絮凝剂性质和结构絮凝剂性质和结构 a.a.线状线状 大于大于 环状环状 b.b.分子量分子量l 溶液的溶液的phph及及t t ph ph主要影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，主要影响离子型絮凝剂中功能团的电离度，从而影响了分子链的伸展状态，改变了架桥能力。从而影响了分子链的伸展状态，改变了架桥能力。l 搅拌速度和时间搅拌速度和时间：l 絮凝剂用量絮凝剂用量: :絮凝效果呈钟形变化。絮凝效果呈钟形变化。l 助滤剂助滤剂：添加助滤剂能增加絮凝效果

10、。：添加助滤剂能增加絮凝效果。（3 3）絮凝作用的影响因素：）絮凝作用的影响因素：凝聚、絮凝与盐析的区别和联系凝聚、絮凝与盐析的区别和联系 联系：联系： 絮凝、凝聚和盐析都是使蛋白质等胶体从溶絮凝、凝聚和盐析都是使蛋白质等胶体从溶液中析出的方法，但其原理和方法有所不同。液中析出的方法，但其原理和方法有所不同。区别：区别：絮凝絮凝是指通过聚电解质的是指通过聚电解质的架桥作用架桥作用，将溶液中，将溶液中的蛋白质连接起来，增大蛋白质的尺度而不是蛋白的蛋白质连接起来，增大蛋白质的尺度而不是蛋白沉淀。沉淀。 凝聚和盐析虽然都是采用无机盐使蛋白质沉淀，但凝聚和盐析虽然都是采用无机盐使蛋白质沉淀，但凝聚所用

11、的是含有高价离子的无机盐凝聚所用的是含有高价离子的无机盐，主要是由于，主要是由于蛋白质与带相反电荷的高价离子发生电荷中和作用蛋白质与带相反电荷的高价离子发生电荷中和作用而使得蛋白质聚集沉淀，所以凝聚所需的盐浓度很而使得蛋白质聚集沉淀，所以凝聚所需的盐浓度很低。而低。而盐析使用的是中性盐盐析使用的是中性盐，主要依靠盐离子的亲，主要依靠盐离子的亲水性，夺走与蛋白质亲和的水而沉淀，因而盐析通水性，夺走与蛋白质亲和的水而沉淀，因而盐析通常需要较高的盐浓度。常需要较高的盐浓度。 5.5.加助滤剂加助滤剂（1 1）定义：）定义： 助滤剂是一种质地坚硬、颗粒均匀，不可压缩助滤剂是一种质地坚硬、颗粒均匀，不可

12、压缩的，具有吸附胶体能力的惰性物质。的，具有吸附胶体能力的惰性物质。（2 2）原理：）原理： 助滤剂具有吸附胶体能力，可以改变滤饼的结助滤剂具有吸附胶体能力，可以改变滤饼的结构（使其成网状），降低滤饼的可压缩性（可构（使其成网状），降低滤饼的可压缩性（可压缩变成部分可压缩），从而降低过滤的阻力，压缩变成部分可压缩），从而降低过滤的阻力，加快过滤速度。加快过滤速度。（3 3）方法）方法a. a. 过滤前：预先涂助滤剂于介质上（旋转真过滤前：预先涂助滤剂于介质上（旋转真空过滤机）空过滤机）b. b. 过滤时：按一定比例加入待过滤的料液中过滤时：按一定比例加入待过滤的料液中（板框压滤机）（板框压滤机

13、）（4 4）选择依据）选择依据a.a.根据目的物的性质品种选择根据目的物的性质品种选择b.b.根据过滤介质和过滤情况品种选择根据过滤介质和过滤情况品种选择c.c.根据过滤速度及滤液澄清度粒度选择根据过滤速度及滤液澄清度粒度选择d.d.用量选择用量选择6.6.加反应剂生成不溶性化合物加反应剂生成不溶性化合物如：新生霉素发酵液中加氯化钙和磷酸钠如：新生霉素发酵液中加氯化钙和磷酸钠（三）（三） 除杂除杂1.1.杂蛋白的去除杂蛋白的去除（1 1）等电点沉淀）等电点沉淀 蛋白质在某一ph下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点等电点。因为羧基的电离羧基的电离度比氨基大度比氨基大，故蛋白质的酸性酸性性质通常

14、强于碱性强于碱性，因而很多蛋白质的等电点等电点都在酸性范围内（ph 4.0ph 4.05.55.5）。加热：加热：在链霉素生产中，在在链霉素生产中，在ph3.0ph3.0时，加热至时，加热至70707575，维持维持30min30min，黏度降为，黏度降为1/61/6，过滤速度提高，过滤速度提高10-10010-100倍。倍。加有机溶剂、表面活性剂、酸碱、重金属等。加有机溶剂、表面活性剂、酸碱、重金属等。 如：在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸如：在酸性溶液中，蛋白质能与一些阴离子如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐

15、等形成沉淀；盐等形成沉淀；如：在碱性溶液中，能与一些阳离子，如如：在碱性溶液中，能与一些阳离子，如agag，cucu2 2，znzn2 2，fefe2 2和和pbpb2 2等形成沉淀。等形成沉淀。 变性蛋白质溶解度较小。最常用的使蛋白质变性的方法变性蛋白质溶解度较小。最常用的使蛋白质变性的方法是加热。加热还能使液体粘度降低，加快过滤速度。是加热。加热还能使液体粘度降低，加快过滤速度。该法只适用于对热较稳定的生化物质。该法只适用于对热较稳定的生化物质。（2）变性法）变性法在发酵液中加入一些反应剂，相互反应后生成的在发酵液中加入一些反应剂，相互反应后生成的沉淀物可吸附蛋白质而使其沉淀。沉淀物可吸附

16、蛋白质而使其沉淀。如在如在四环素发酵液四环素发酵液中加入黄血盐和硫酸锌，两者中加入黄血盐和硫酸锌，两者反应生成反应生成k k2 2znzn3 3fe(cn)fe(cn)6 6 2 2在在枯草杆菌枯草杆菌的碱性蛋白酶发酵液中加入氯化钙和的碱性蛋白酶发酵液中加入氯化钙和磷酸盐等磷酸盐等（4 4）盐析）盐析（3）吸附）吸附2 不溶性多糖的去除不溶性多糖的去除当发酵液中含有较多不溶性多糖时，黏度增大，固液分离困难，可用酶将其转化为单糖。3.高价无机离子的去除镁离子的去除：镁离子的去除： 常用草酸常用草酸 与钙离子生成草酸钙沉淀与钙离子生成草酸钙沉淀 草酸为弱酸，对发酵产物的破坏较小，草酸钙沉淀草酸为弱

17、酸，对发酵产物的破坏较小，草酸钙沉淀还能促进蛋白质凝固，有利于提高滤液的过滤速度；还能促进蛋白质凝固，有利于提高滤液的过滤速度； 草酸的溶解度较小，需大用量时，可用草酸钠取代；草酸的溶解度较小，需大用量时，可用草酸钠取代；草酸价格较高，生产上一般需回收草酸价格较高，生产上一般需回收钙离子的去除：钙离子的去除：铁离子的去除铁离子的去除： 常用三聚磷酸钠常用三聚磷酸钠 与镁离子形成可溶性络合物与镁离子形成可溶性络合物 nana5 5p p3 3o o1010 + mg + mg 2+2+ = mgna = mgna3 3p p3 3o o1010 + 2na + 2na+ +常用黄血盐常用黄血盐

18、与铁离子形成普鲁氏蓝沉淀与铁离子形成普鲁氏蓝沉淀3k3k4 4fe(cn)fe(cn)6 6 + 4fe + 4fe 3+3+ = fe = fe4 4fe(cn)fe(cn)6 6 3 3 + 12k + 12k+ +三三. .悬浮液的分离方法和分类：悬浮液的分离方法和分类：（一）分类（一）分类通常微生物的发酵液多属非牛顿型液体，具可压缩性。在恒压条件下，可压缩性滤饼的比阻值rc视为常数，其过滤方程为： f过滤面积；过滤面积； v滤液体积；滤液体积； rm过滤介质阻力；过滤介质阻力； rc滤饼阻力；滤饼阻力； 黏度黏度（二）过滤（二）过滤)r(rpdtdvfcm11.过滤的方程式过滤的方程式2.2.影响过滤的因素影响过滤的因素n（1 1）悬浮液的性质及大小）悬浮液的性质及大小n（2 2）粘度）粘度n（3 3）操作条件：）操作条件：t t、phph、p