第3章蛋白质的共价结构

1、第第2 2章章 蛋白质的共价结构蛋白质的共价结构 即蛋白质的一级结构，多肽链的氨即蛋白质的一级结构，多肽链的氨基酸序列基酸序列 本章主要内容本章主要内容蛋白质通论蛋白质通论 多肽多肽 蛋白质一级结构的测定蛋白质一级结构的测定 蛋白质是由一条或多条多肽蛋白质是由一条或多条多肽( (polypeptide) )链以特殊方式结合而成的生物大分子。链以特殊方式结合而成的生物大分子。蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在分子量在60006000道尔顿以上的多肽称为蛋白道尔顿以上的多肽称为蛋白质。质。蛋白质分子量变化范围很大蛋白质分子量变化范围很大, , 从大约从

2、大约60006000到到1,000,0001,000,000道尔顿甚至更大。道尔顿甚至更大。一、蛋白质通论一、蛋白质通论蛋白质的化学组成和分类蛋白质的化学组成和分类蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次蛋白质功能多样性蛋白质功能多样性一、蛋白质通论一、蛋白质通论一、蛋白质通论一、蛋白质通论1.1.蛋白质的化学组成和分类蛋白质的化学组成和分类 （1 1）蛋白质包含）蛋白质包含c、h、o、n、s及其它，及其它，蛋白质的平均含蛋白质的平均含n量为量为16%，故蛋白质含量故蛋白质含量= = 蛋白氮蛋白氮6.256.25。 （2 2）蛋白质分类）蛋白质分类 依据外形分为球状蛋白

3、质和纤维状蛋白质；依据外形分为球状蛋白质和纤维状蛋白质； 依据组成分为简单蛋白质和结合蛋白质。依据组成分为简单蛋白质和结合蛋白质。 （2 2）蛋白质的分类）蛋白质的分类按照蛋白质的外形分为球状蛋白质和纤维按照蛋白质的外形分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。状蛋白质。球状蛋白质：外形接近球形或椭圆形，溶球状蛋白质：外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。于这一类。纤维状蛋白质：分子类似纤维或细棒。它纤维状蛋白质：分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质维状蛋白质。按照蛋白质

4、的组成，分为简单蛋白和结合蛋白。按照蛋白质的组成，分为简单蛋白和结合蛋白。简单蛋白又称为单纯蛋白质，这类蛋白质只含简单蛋白又称为单纯蛋白质，这类蛋白质只含由由 - -氨基酸组成的肽链，不含其它成分。如清氨基酸组成的肽链，不含其它成分。如清蛋白和球蛋白、谷蛋白和醇溶谷蛋白、精蛋白蛋白和球蛋白、谷蛋白和醇溶谷蛋白、精蛋白和组蛋白、硬蛋白。和组蛋白、硬蛋白。结合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而结合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成，如色蛋白、糖蛋白、脂蛋白、核蛋白等。成，如色蛋白、糖蛋白、脂蛋白、核蛋白等。 （2 2）蛋白质的分类）蛋白质的分类一、蛋白质通论一、蛋白质通论2.2.蛋白质构象和

5、蛋白质结构的组织层次蛋白质构象和蛋白质结构的组织层次 蛋白质构象：蛋白质的三维结构。蛋白质构象：蛋白质的三维结构。 组织层次：一级、二级、三级、四级结构。组织层次：一级、二级、三级、四级结构。3.3.蛋白质功能多样性蛋白质功能多样性 催化、调节、转运、贮存、运动、结构成分、催化、调节、转运、贮存、运动、结构成分、支架作用、防御和进攻、异常功能。支架作用、防御和进攻、异常功能。 氨基酸连接的化学键氨基酸连接的化学键肽的命名肽的命名多肽的性质多肽的性质天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽二、多肽二、多肽一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称

6、为肽键，所形成的化间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。合物称为肽。二、多肽二、多肽1.1.氨基酸连接的化学键氨基酸连接的化学键 肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。组成肽键的原子处于同一平面。组成肽键的原子处于同一平面。肽键中的肽键中的c-nc-n键具有部分双键性质，不能自由旋转。键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构反式结构存在存在。concn+o-cncohch2nchcoohr1+ h2nchcoohr2nchcoohr2hh2nchcr1o肽键二肽由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的

7、肽则称为多肽。组成多肽的氨氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。基酸单元称为氨基酸残基。ccnccnccnccncch2chch2ch2ch2coo-ohco2hch2conh2ohch3h3n+oooohhhhhhhhhservaltyraspglnch3n-端c-端肽键在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序列顺序称为氨基酸顺序通常在多肽链的一端含有一个游离的 - -氨基，称为氨氨基，称为氨基端或基端或n-n-端；端；在另一端含有一个游离的 - -羧基，称为羧基，称为羧基端或羧基端或c-c-端。端。氨基酸的

8、顺序是从n-n-端的氨基酸残基开始，以端的氨基酸残基开始，以c-c-端氨端氨基酸残基为终点基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为：ser-val-tyr-asp-gln根据参与其组成的氨基酸残基从根据参与其组成的氨基酸残基从n-n-末端开始命名。末端开始命名。如上述五肽可称为丝氨酰缬氨酰酪氨酰天门冬氨如上述五肽可称为丝氨酰缬氨酰酪氨酰天门冬氨酰谷氨酰氨，酰谷氨酰氨，n-n-末端氨基酸残基在左，末端氨基酸残基在左，c-c-末端氨末端氨基酸残基在右。基酸残基在右。 2.2.肽的命名肽的命名 ccnccnccnccncch2chch2ch2ch2coo-ohco2hch2conh2ohch3h

9、3n+oooohhhhhhhhhservaltyraspglnch3n-端c-端肽键3.3.多肽的性质多肽的性质(1)多肽的两性离解多肽的两性离解(2)(2)多肽的呈色反应多肽的呈色反应多肽可与多种化合物作用，产生不同的颜色多肽可与多种化合物作用，产生不同的颜色反应。这些显色反应，可用于多肽的定性或反应。这些显色反应，可用于多肽的定性或定量鉴定。定量鉴定。如茚三酮反应，是由茚三酮与如茚三酮反应，是由茚三酮与n-n-末端氨基酸残末端氨基酸残基反应生成呈色物质。基反应生成呈色物质。多肽的双缩脲反应是多肽特有的颜色反应;双缩脲是两分子的尿素经加热失去一分子nh3而得到的产物。双缩脲能够与碱性硫酸铜作

10、用，产生兰色的铜双缩脲能够与碱性硫酸铜作用，产生兰色的铜- -双缩脲络合物，称为双缩脲反应。含有两个双缩脲络合物，称为双缩脲反应。含有两个以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特以上肽键的多肽，具有与双缩脲相似的结构特点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫点，也能发生双缩脲反应，生成紫红色或蓝紫色络合物。色络合物。这是多肽定量测定的重要反应。4.4.天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽在生物体中，多肽最重要的存在形式是在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。作为蛋白质的亚单位。但是，也有许多分子量比较小的多肽以但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特

11、游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。殊的生理功能，常称为活性肽。如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的多蛋白质的一级结构包括组成蛋白质的多肽链数目，多肽链的氨基酸顺序，以及肽链数目，多肽链的氨基酸顺序，以及多肽链内或链间二硫键的数目和位置。多肽链内或链间二硫键的数目和位置。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。它是蛋白质生物功能的基础。测序的一般策略测序

12、的一般策略末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定多肽链的部分裂解和肽段混合物的分多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化离纯化肽段氨基酸序列的测定肽段氨基酸序列的测定三、蛋白质一级结构的测定三、蛋白质一级结构的测定1. 测序的一般策略测序的一般策略(1)(1)测定蛋白质分子中多肽链的数目。测定蛋白质分子中多肽链的数目。根据末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质根据末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量，即可确定蛋白质分子中多肽链分子量，即可确定蛋白质分子中多肽链的数目。的数目。(2)(2)多肽链的拆分。多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。拆

13、分。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。多肽链间的二硫键。1. 测序的一般策略测序的一般策略(3)(3)多肽链完全水解，测定每条多肽链的多肽链完全水解，测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比。子比。(4)(4)分析多肽链的分析多肽链的n-n-末端和末端和c-c-末端。末端。1. 测序的一般策略测序的一般策略（3 3）多肽链完全水解）多肽链完全水解酸水解酸水解常用常用6 mol/l6 mol/l的盐酸或的盐

14、酸或4 mol/l4 mol/l的硫酸在的硫酸在105-105-110110条件下进行水解，反应时间约条件下进行水解，反应时间约2020小时。小时。优点：不容易引起水解产物的消旋化。优点：不容易引起水解产物的消旋化。缺点：缺点：色氨酸色氨酸被完全破坏；被完全破坏；含有羟基的丝氨酸含有羟基的丝氨酸或苏氨酸等有一小部分被分解；或苏氨酸等有一小部分被分解；天门冬酰胺天门冬酰胺和和谷氨酰胺谷氨酰胺的酰胺基被水解。的酰胺基被水解。一般用一般用5 mol/l5 mol/l氢氧化钠煮沸氢氧化钠煮沸10-2010-20小时。小时。水解过程中许多氨基酸都受到不同程度水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率

15、不高。的破坏，产率不高。缺点：部分水解产物发生缺点：部分水解产物发生消旋化消旋化。优点：优点：色氨酸色氨酸在水解中不受破坏。在水解中不受破坏。（3 3）蛋白质完全水解）蛋白质完全水解碱水解碱水解(5)(5)断裂多肽链内的二硫键：过甲酸氧化法、断裂多肽链内的二硫键：过甲酸氧化法、巯基化合物还原法。巯基化合物还原法。 (6)(6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。套肽段或肽碎片，并将其分离开来。1. 测序的一般策略测序的一般策略由几条多肽链构成的蛋白

16、质分子存在两种形式：由几条多肽链构成的蛋白质分子存在两种形式：1.1.几条多肽链借助非共价键连接在一起，可用几条多肽链借助非共价键连接在一起，可用8mol/l8mol/l尿素或尿素或6mol/l6mol/l盐酸胍处理，即可分开多盐酸胍处理，即可分开多肽链肽链( (亚基亚基).).2.2.几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/l8mol/l尿素或尿素或6mol/l6mol/l盐酸胍存在下，用过量的盐酸胍存在下，用过量的 - -巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新用烷基化试剂

17、保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。被氧化。(7)(7)测定每个肽段的氨基酸序列。测定每个肽段的氨基酸序列。(8)(8)确定肽段在多肽链中的次序。确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。基酸顺序。1. 测序的一般策略测序的一般策略(9)(9)确定原多肽链中二硫键的位置。确定原多肽链中二硫键的位置。1. 测序的一般策略测序的一般策略一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过再利用双向

18、电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。确定二硫键的位置。多肽链末端氨基酸分为两类：多肽链末端氨基酸分为两类：n-n-端氨基端氨基酸和酸和c-c-端氨基酸。端氨基酸。在肽链末端氨基酸残基分析中，最重要在肽链末端氨基酸残基分析中，最重要的是的是n-n-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。2. 2. 末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定 n-末端分析末端分析 :二硝基氟苯法（二硝基氟苯法（dnfb、fdnb，sanger试剂）试剂）丹磺酰氯法

19、（丹磺酰氯法（dns） 苯异硫氰酸酯法（苯异硫氰酸酯法（pitc，edman 法）法）氨肽酶氨肽酶法法 2. 2. 末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定 sangersanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链n-n-端的端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（dnpdnp）。）。在酸性条件下水解，得到黄色在酸性条件下水解，得到黄色dnp-dnp-氨基酸。该产物能够用乙醚氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的抽提分离。不同的dnp-dnp-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。o

20、2nfno2+ h2nchcrohnchcroo2nno2h+h2oo2nno2hnchcrooh+氨基酸dnfbn-端氨基酸dnp衍生物dnp-氨基酸（1）n-末端分析末端分析在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与与n-n-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰- -氨基酸。氨基酸。此法的优点是丹磺酰此法的优点是丹磺酰- -氨基酸有很强的荧光性质，检测氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到灵敏度可以达到1 1 1010-9-9molmol。dnsn(ch3)2so2clh2nchcrohnchcroso

21、2n(ch3)2+水解n(ch3)2so2hnchcrooh+氨基酸丹磺酰氯多肽n-端丹磺酰n-端氨基酸丹磺酰氨基酸（1）n-末端分析末端分析edman edman （苯异硫氰酸酯法）法。此法的特点是能够（苯异硫氰酸酯法）法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链不断重复循环，将肽链n-n-端氨基酸残基逐一进行标端氨基酸残基逐一进行标记和解离。还用于记和解离。还用于肽段氨基酸序列的测定。肽段氨基酸序列的测定。 ncsnhchcor2nchcor1hhnhs:cchcor1hnnhchcor2snhcnhocr1chnh2chcor2ncochnhscr1（1）n-末端分析末端分析edman 氨肽

22、酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的n-n-端逐个的向里水解。端逐个的向里水解。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的n-n-末端残基序列。末端残基序列。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶。（1）n-末端分析末端分析c-末端分析末端分析 :肼解法肼解法羧肽酶法羧肽酶法2. 2. 末端氨基酸残基的鉴定末端氨基酸残基的鉴定 多肽与肼在无水条件下加热，c

23、-端氨基酸从肽链上解离，其余的氨基酸变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与c-端氨基酸分离。h2nch crohnch croorncchhnohn-1n-端氨基酸 c-端氨基酸orncchh2nohh2nch cronhnh2+h+nh2nh2氨基酸酰肼c-端氨基酸（2）c-末端分析末端分析羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的c-c-端逐个的水解氨基酸。根据不同的反应时端逐个的水解氨基酸。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的从而知道蛋白质的c-c-末端残基序列。

24、末端残基序列。目前常用的羧肽酶有四种：目前常用的羧肽酶有四种：a,b,ca,b,c和和y y。羧肽酶羧肽酶a a能水解除能水解除pro,arg pro,arg 和和lys lys 以外的所有以外的所有c-c-末端氨基酸残基；末端氨基酸残基；b b只能水解只能水解arg arg 和和lys lys 为为c-c-末端残基的肽键。末端残基的肽键。（2）c-末端分析末端分析化学裂解法化学裂解法cnbr 裂解：裂解：met羧基形成的肽键羧基形成的肽键 nh2oh裂解：裂解：asn-gly/ asn-leu, asn-ala之间肽键之间肽键 3.3.多肽链的部分裂解和肽段混合物的多肽链的部分裂解和肽段混合物的分离纯化分离纯化 酶解法酶解法:胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶嗜热菌蛋白酶裂解后通过凝胶过滤、凝胶电泳和高裂解后通过凝胶过滤、凝胶电泳和高效液相色谱分离纯化。效液相色谱分离纯化。 3.3.多肽链的部分裂解和肽段混合物