P53基因突变检测方法

1、2、试剂和耗材QIAamp?DNA Blood Mini Kit（GIAGEN ，德国 )Platinum?Taq DNA Polymerase High Fidelity （Invitrogen,11304-102）Nuclease-Free Water (Promega,P1195)d NTP Mix (Promega,P151B)PCR 引物：北京博迈德科技有限公司合成DNA 分子定量标准： DL10000 DNA Marker(TAKARA, 大连宝生物 ) PCR 产物回收纯化试剂盒（ BioSpin Gel Extraction kit ，日本 Bioer 技术有限公司）0.510

2、 l、220 l、20200 l、2001000 l 吸头（美国 Axygen，公司）EP 管3、仪器Tannon1600R凝胶成像系统分析仪（上海天龙公司） ；Eppendorf 5417R 高速冷冻离心机（ Eppendorf 公司，德国）Allegra 6R 离心机（ Beckman-Coulter 公司，美国）MVS-1 型涡旋混合器（北京北德科学仪器厂）移液器 2 l、10 l、50 l、200 l、1000l（Eppendorf 公司，德国）级生物安全柜NU425-400E（NEWAIR 公司，美国）X-15R 高速冷冻离心机（ BECKMAN COULTER 公司，美国）Eppe

3、ndorf Mastercycter PCR仪（ Eppendorf 公司德国）电泳仪： Universal 024BR（Bio-Rad 公司，美国）电热恒温水浴器（北京来亨科贸有限责任公司）凝胶成像分析系统： Tocan 240 全自动凝胶成像系统（中国）测序仪： GenomeLab CEQ/GeXP（BECKMANCOULTER 公司，美国）20l、200l和 1000l加样器（吉尔森公司，法国）旋涡震荡器（ Scientific Industries 公司，美国）二、实验方法1、样品采集，送检和保存.乙二胺四乙酸（ EDTA） -3K 抗凝管采集 HIV 和 HBV 合并感染者外周静脉血

4、，于 24 h 内测定 CD4+T 淋巴细胞计数，抗凝血经常规离心分离全血中间层，分装后 -80冻存用于 P53 基因变异的测定。2、血浆样本 DNA 的提取取200 l全血中间层于 1.5ml 无菌 EP管中，加入 20l蛋白酶 K ；再加入 200lAL 缓冲液，涡旋振荡 15秒，56孵育 10分钟；瞬时离心 EP管，加入 200l无水乙醇，涡旋振荡 15秒，再瞬时离心收集管壁残液；将上述混合液加入到 QIAMP 离心柱中， 6000g离心 1分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管，注意不要让离心柱沾染废液；离心柱中加入 500l缓冲液 AW1 ，6000g离心 1分钟，弃去含废液的

5、收集管，更换新的废液收集管； 离心柱中加入 500l缓冲液 AW2 ，20000g离心 3分钟，弃去含废液的收集管，更换新的废液收集管； 20000g离心 1分钟，弃去含废液的收集管， 将离心柱插入 1.5ml无菌 EP管中，在离心柱中加入 200l 洗脱液 AE（事先预热至 70），室温孵育 1分钟后， 6000g离心 1分钟， EP管中收集的即为目标 DNA ；0.7%TAE- 琼脂糖凝胶电泳，验证 DNA 提取质量， -20保存备用。3、PCR 扩增 P53 序列使用引物如下：名称方向核苷酸组成Primer15外侧cttgccacaggtctccccaaPrimer23外侧aggggtc

6、agaggcaagcaga反应体系（ 50ul）组分体积（）l10PCR 反应缓冲液5dNTP（2.5mM ）5Primer1-forward (20uM )1Primer2-reverse (20uM )1Promega Taq (5U/ l)0.5DNase/RNase free water32.5提取的 DNA5Total volume50.PCR 反应条件： 95 变性 30 秒， 55退火 30 秒， 72 延伸 90 秒， 28 个循环；4、PCR反应产物纯化取终产物 5l进行 1%琼脂糖凝胶电泳 ( 含溴化乙啶 0.5 g/ml)， 100V电泳 40 min，经 Ultra-V

7、iolet Product 凝胶成像后与 marker比对，确认所需片段 250bp，用 QIAquick Gel Extraction Kit 试剂盒纯化基因片段。5、PCR 反应产物测序将 PCR 反应产物切胶回收，使用 BECKMAN公司的 GEXP 系统测序GenomeLab CEQ/GeXP遗传分析系统测序分析实验步骤：1，配置测序 PCR反应试剂：总体积 20ul10ul纯水 (补足至总体积 ) 0-9.5ul0-3.5ul模板 ( 用量见附表 ) 0.5-10ul0.5-4ul引物 (5pmol/ul) 1ul 1ulDTCS Mix 8ul4ul质粒 DNA 模板的热处理 :

8、(线性 DNA 模板 ,如果为 PCR产物无需加热 )；在热循环仪上加热 DNA 模板和水 : 96 C 1-3Min；自然凉到室温后再加入其它组分；2，热循环反应，程序如下：1、 96 C 20sec2、 50 C 20sec3、 60 C 4min Back to step 1, for 30 cycles.4、 4 C Holding3、终止反应a, 按照 NaOAC ： EDTA ：Glycogen = 1：1 ：0.5 准备测序反应终止液（即用即配，低温放置）；b, 取出测序反应产物，稍微离心；按照2.5ul/10ul向测序反应产物加入反应终止液。4、乙醇沉淀a, 每个反应管中加入3

9、0ul 95% 冰乙醇 /10ul Reaction；轻混匀，离心（ 4C，14000rcf，15min ），去上清；b, 加 100ul 70%冰乙醇洗脱残留盐，离心（4C，12000rcf，5min ） ,去上清；.c, 再次加 100ul 70% 冰乙醇洗脱残留的盐， 离心（ 4C，12000rcf ，5min ），去上清； d, 低速离心 10S ，用 Tip 头吸干残留液体， 37 C避光干燥， 35 Min 。e, 在每个样品管中加入 20ul SLS, 反复吹打 DNA 沉淀（ 10-20 次），静置 3min ，稍微离心；5、CEQ上样a, 小心转移样品至 CEQ 样品板 (

10、不要出现气泡 ), 加一滴石蜡油覆盖样品；b, 在缓冲液板孔内加入3/4 体积的测序缓冲液；上机进行测序反应ABI 3500 测序一 、实验试剂和耗材准备：（一）实验试剂：纯化好的PCR 产物，测序引物， Bigdye v3.1, ddH2O，POP7胶，Sequence Standard(3130), 5 Buffer, HiDi（二）实验耗材： 96 孔板， 0.2EP 管，移液枪，计时器，记号笔二、实验操作具体步骤：（一）测序反应体系（标准） ：DNA（ 35ng/ul ）6ul引物（ 20pmol/ul ）1ulddH2O8ulBigdye2ul5Buffer3ul总体积20ul测序

11、PCR循环条件：961 min（ 96 10sec, 50 5sec,60 4min）x25 循环4 保温（二）测序产物纯化（酒精 /EDTA法纯化）：1 每管加入 5 ul 125mM EDTA, 加到管底；2 加入 60ul100%酒精，封严，震荡 4 次，室温放置 15min;3 3000g 4 离心 30min，马上倒置 96 孔板， 185g 离心 1min;4 加入 60ul70%酒精，3000g4离心 15min, 马上倒置 96 孔板，185g 离心 1min；5 70%酒精重复洗涤 1 次或 2 次；6让残余的酒精在室温挥发干，加入10ul Hi-Di甲酰胺， 95变性 4min，迅速置冰上 4min, 上样电泳。6、基因测序分析.7、统计学处理采用 Epidata 软件编制录入数据库，应用PASW Statistics 18.0软件进行统计学分析。P53 突变点野生型 p53 249 Arg的编码子为 agg,突变变成 Ser 后的编码子为agt )gactgtacca ccat