DNA芯片技术的原理与应用

1、dna芯片技术的原理与应用 主要内容 dna芯片技术的概况dna芯片技术的应用概况存在的一些问题及展望1 dna芯片技术的一些概况 dna芯片也称dna微阵列,是生物芯片的一种。基因芯片原理最初是由核酸的分子杂交衍生而来的,即应用已知序列的核酸探针对未知序列的核酸序列进行杂交检测1.1 dna芯片技术的概念和基本原理 dna芯片技术，实际上就是一种大规模集成的固相杂交，是指在固相支持物上原位合成( situ synthesis)寡核苷酸或者直接将大量预先制备的dna探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交。通过计算机对杂交信号的检测分析，得出样品的遗传信息(基因序列及表

2、达的信息)。由于常计算机硅芯片作为固相支持物，所以称为dna芯片。 基因芯片制备及检测流程是利用原位合成法或将已合成好的一系列寡核苷酸以预先设定的排列方式固定在固相支持介质表面,形成高密度的寡核苷酸的阵列,样品与探针杂交后,由特殊的装置检出信号,并由计算机进行分析得到结果。原理如下图：基因芯片电子芯片集成电子线路集成分子线路近7(2011.9前)年来公开发表的与基因芯片相关的学术论文1.2 dna芯片分类 据不同分类标准,dna芯片的分类如下: v(1)根据固相支持物的不同,dna芯片分为无机无机(玻璃、硅片、 陶瓷等)和有机有机(聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等)芯片。v(2)根据芯片上所用

3、探针不同分为寡核苷酸芯片寡核苷酸芯片和cdna 芯片芯片。v(3)根据芯片点样方式不同,可分为原位合成芯片原位合成芯片、微矩阵芯微矩阵芯片片(分喷点和针点)和电定位芯片电定位芯片3类。v(4)根据用途的不同分类为基因表达芯片基因表达芯片和基因测序芯片基因测序芯片。1.3 dna芯片的优点 作为新一代基因诊断技术，dna芯片的突出特点在于快速、高效、敏感、经济，平行化、自动化等，与传统基因诊断技术相比，dna芯片技术具有明显的优势： （1）快速准确 （2） 检测效率高 （3）基因诊断的成本降低。 （4）自动化程度高 （5） 避免了交叉感染 （6）多功能 （7）高度的平行性dna芯片技术的步骤dn

4、a芯片的制备光蚀刻合成法 电压印刷法 点样法 样品的制备 杂交 杂交图谱的检测和读出 为了提高结果的准确性，来自血液或组织中的dna/mrna样本须先行扩增，然后再被荧光素或同位素标记成为探针。杂交条件的选择要根据芯片上核酸片段的长短及其本身的用途来定。激光共聚焦荧光检测系统 ccd摄像原理 检测系统质谱法 1.4 dna芯片的制备过程1.4.1 dna芯片的制备 原位合成法原位合成法(in situ synthesis)借鉴半导体照相借鉴半导体照相平版印刷技术平版印刷技术,在固相载体上原位合成寡核苷酸探在固相载体上原位合成寡核苷酸探针序列。主要有光蚀刻法及压电印刷法。针序列。主要有光蚀刻法及

5、压电印刷法。 光蚀刻法基本过程为光蚀刻法基本过程为:光有选择地照射到有光掩蔽光有选择地照射到有光掩蔽剂保护的玻璃片上剂保护的玻璃片上,以去掉玻璃片上的光敏集团以去掉玻璃片上的光敏集团,激激活活dna合成过程合成过程,在去掉光敏集团的特定部位偶联在去掉光敏集团的特定部位偶联一个光保护碱基一个光保护碱基,再将第二个光掩蔽剂置于这个受再将第二个光掩蔽剂置于这个受光保护的碱基上光保护的碱基上,如此不断地去保护和偶联如此不断地去保护和偶联,就可以就可以得到寡核苷酸片断得到寡核苷酸片断,许多这样的不同序列的片段就许多这样的不同序列的片段就构成了构成了dna方阵。方阵。 原位合成原位合成(in situ s

6、ynthesis)light directed oligonucleotide synthesis.a s o l i d s u p p o r t i s derivatized with a covalent linker molecule terminated w i t h a p h o t o l a b i l e protecting group. light is directed through a mask to deprotect and activate s e l e c t e d s i t e s , a n d protected nucleotides

7、couple to the activated sites. the process is repeated, activating different sets of sites and coupling different bases allowing arbitrary dna probes to be constructed at each site.光定向合成寡核苷酸 压电印刷法的基本原理类似于目前采用压电印刷法的基本原理类似于目前采用的喷墨打印机的喷墨打印机:打印头在方阵上移动打印头在方阵上移动,在方在方阵每点上电流使喷头放大阵每点上电流使喷头放大,并将装有机某并将装有机某种碱基的

8、试剂滴在晶片表面种碱基的试剂滴在晶片表面,然后固定然后固定,在在洗脱和去保护后另一轮寡核苷酸的延伸洗脱和去保护后另一轮寡核苷酸的延伸就可以继续进行。压片印刷法由于不需就可以继续进行。压片印刷法由于不需要与载体表面直接接触要与载体表面直接接触,故有很高的效率故有很高的效率,但制造工艺还不太成熟。但制造工艺还不太成熟。喷墨打印技术喷墨打印技术离片合成法离片合成法(off-chip synthesis)首先利用各种方首先利用各种方法制备出寡核苷酸探针，再由具有多个微细加样法制备出寡核苷酸探针，再由具有多个微细加样孔的阵列复制器孔的阵列复制器(arraying and replicating devi

9、ce,ard)及由电脑控制的机器将探针按一定的及由电脑控制的机器将探针按一定的顺序固定在固相载体表面，再由紫外交线交联固顺序固定在固相载体表面，再由紫外交线交联固定后得到定后得到dna方阵。方阵。该方法优点是芯片制造速度快该方法优点是芯片制造速度快,成本低成本低,而且芯片之而且芯片之间制造误差小。其缺点是与原位合成法相比间制造误差小。其缺点是与原位合成法相比,构成构成方阵的方阵的dna片段需要先合成、纯化，以及在制造片段需要先合成、纯化，以及在制造dna芯片前必须将如此大量具有微小差别的片段芯片前必须将如此大量具有微小差别的片段分别保存分别保存,并且需要特制的自动点样装置。并且需要特制的自动点

10、样装置。 点样法 即预先合成寡核苷酸，肽核苷酸或分离得到cdna，再通过点样机直接将其点到芯片上。寡核苷酸或肽核苷酸的合成主要是通过多孔玻璃合成法。肽核苷酸虽然在制备上比较复杂，但是它与dna探针相比，由于pna（肽核酸）与dna结合的复合物更加稳定和特异，因而更加有利于单碱基错配基因的检测。 来自某一细胞的cdna必须进行预处理，纯化，扩增以及分类，然后再利用机械手把它们准确地固定在基板的相应位置上，为了保证cdna芯片检测的准确性，在制备cdna芯片以前必须提高低表达基因cdna的丰度，降低高表达基因cdna的丰度。1.4.2 样品的制备 样品的制备包括：样品的分离纯化，扩增，标样品的制备

11、包括：样品的分离纯化，扩增，标记记 分离纯化：样品来源于活的细胞，使用一定方分离纯化：样品来源于活的细胞，使用一定方法分离并纯化法分离并纯化dna或或rna（特别是（特别是mrna）。）。只有达到一定纯度的样品，才能保证后续操作只有达到一定纯度的样品，才能保证后续操作的正确。的正确。 样品的扩增：扩增的目的在于获得足够的样品的扩增：扩增的目的在于获得足够的样品量。现已发展出固相样品量。现已发展出固相pcr系统。系统。样品的标记：主要采用荧光标记法，也可样品的标记：主要采用荧光标记法，也可用生物素，或放射性核标记。标记的方式用生物素，或放射性核标记。标记的方式采用采用pcr或或rt-pcr。常用

12、的荧光色素为。常用的荧光色素为cy3、cy5。用。用cy3、cy5标记标记dntp，经，经pcr后，产物即可被标记。待测样品和对后，产物即可被标记。待测样品和对照可采用双色荧光标记。照可采用双色荧光标记。1.4.3 分子杂交分子杂交芯片的杂交：将已知序列的芯片的杂交：将已知序列的dna探探针显微固化于支持物表面，将已标记针显微固化于支持物表面，将已标记好的样品与之进行杂交，杂交过程一好的样品与之进行杂交，杂交过程一般在般在30分钟完成。分钟完成。电子基因芯片：杂交速度更快。电子基因芯片：杂交速度更快。采用肽核酸（采用肽核酸（peptide nucleic acid，pna）探针可消除）探针可消

13、除dna二级结构的二级结构的影响。影响。1.4.4 遗传信息检测原理：待测样品与支持物上探针列阵杂交后，荧光标原理：待测样品与支持物上探针列阵杂交后，荧光标记的样品结合在芯片的特定位置，未结合的探针被除记的样品结合在芯片的特定位置，未结合的探针被除去；样品与探针严格配对的杂交分子，热力学稳定性去；样品与探针严格配对的杂交分子，热力学稳定性高，产生的荧光信号强，不完全配对的，荧光信号弱；高，产生的荧光信号强，不完全配对的，荧光信号弱；不能杂交不产生荧光信号。不能杂交不产生荧光信号。分析：采用激光扫描或激光共聚焦显微镜采集杂交信分析：采用激光扫描或激光共聚焦显微镜采集杂交信号（位置、强度、颜色），

14、并与对照比较，经相关软号（位置、强度、颜色），并与对照比较，经相关软件进行图像和数据处理。即可得也待测样品的信息。件进行图像和数据处理。即可得也待测样品的信息。经以上获得的数据十分庞大，还需进行分析，比较，经以上获得的数据十分庞大，还需进行分析，比较，归纳，才能得出明晰的结论。归纳，才能得出明晰的结论。 dna芯片的应用领域科学研究临床疾病诊断环境检测药物研究开发法医学鉴定动植物检疫食品检测军事应用健康管理运动医学 dna芯片的应用概况2.1 基因表达的分析与检测 将不同条件下某生物体中转录出的mrna标记后与代表它所有基因而制成的dna芯片杂交,通过分析杂交位点及其信号强弱,就可得出不同条件

15、下各基因的表达情况,还可鉴定出某些未知功能基因,发现新基因,这一应用目前已成为dna芯片研究中的一个重点和热点。 dna芯片具有高度的敏感性和特异性，可自动、快速地同时检测成千上万个基因的表达，基因表达的分析研究有利于揭示不同层次上多基因协同作用的生命过程。应用cdna表达谱芯片对大鼠心脏生长发育及损伤过程中基因表达的改变进行了研究。心脏从胚胎到成年的发育过程中基因表达发生了明显的变化，在1075点芯片上，以成年心脏作为对照，胚胎期的差异表达基因多于初生期的差异表达基因，而在胚胎期中的第13天差异表达最明显，然而当出现心肌肥厚和心力衰竭时，有些在心脏发育期才表达的基因重新被表达，这说明压力负荷

16、诱发的基因表现型与心脏生长发育的基因表现型有某种关联。 2.2 基因突变及多态性的检测 将dna芯片技术用于检测分子突变，能准确地确定突变位点和突变类型，检测多个基因乃至整个基因组的突变。hacia等采用含有96000个寡核苷酸探针芯片研究遗传性乳腺癌和卵巢癌易感基因brca1外显子11位点可能发生的突变，结果在15例患者样品中检测到14例患者存在不同的突变（包括点突变、插入、缺失等突变），而在20个对照样品中均没出现假阳性，同时还检测出了8个单核苷酸多态（snp）。在多态性研究方面，kozal等应用基因芯片研究未曾接触蛋白质酶抑制剂的hiv患者中hivlclade蛋白质酶多态，总共分析了11

17、4例样本，发现蛋白质酶基因存在很大程度的多态性，所示结果与sanger法检测结果一致性达98%。 2.3 测序通过与一组已知序列的寡核苷酸探针杂交，利用杂交谱来重建待测dna序列，该技术为大规模测序提供了方便、快捷、准确的手段，同时也有助于了解基因表达模式、基因突变和多态性，发现新基因以及克隆特异性基因。利用固定的探针与生物样品的靶序列进行分子杂交,得到特定的杂交图谱,进而分析出待测样品的序列,称为杂交测序(sequencing by hybridization, sbh)。chee等人用含135000个核苷酸探针（每个探针的长度为25个核苷）的阵列测定了全长为16.6kb的人线粒体基因序列，

18、准确率达99%。采取样本核酸提取样品标记反转录扩增放大杂交反应洗脱读取信息，诊断结果2.4 在临床上的应用2.4.1疾病诊断人类的疾病与遗传基因密切相关，通过分析比较正常人和病人的基因表达图谱的差异可以得出病变的基因信息，大规模筛查出由基因突变引起的疾病，目前dna芯片已被广泛应用于癌症相关基因突变的快速检测。moch等用532个肾癌组织标本构建了5184点cdna表达谱芯片，通过与正常肾组织进行比较，在癌细胞中筛选出89条基因差异表达，其中有一条编码波形蛋白基因，利用免疫组织化学技术对这条波形蛋白基因表达进行研究，发现它与患者的预后呈显著的负相关，而与肿瘤的分级和分期无关。 基因芯片药物筛选

19、是指通过用药前后表达谱的变化找出靶基因及受靶基因调控的基因是否恢复到正常状态,并且用基因芯片作大规模的药物筛选研究可以省略大量的动物试验,缩短药物筛选所用的时间。现代药物筛选中,对药物筛选影响更直接的是药物作用新靶的发现,而这些新靶一般是由新发现的基因编码的,因而目前大部分研究人员以基因为基础的药物研究过程是:基因组-新靶点筛选。先导物-药物,即基因-受体-药物。2.4.2 药物筛选药物筛选 近年来,根据组合化学理论设计的各种化合物文库开始用于药物筛选,其中可放大的生物文库的建立和应用,以及高通量自动化药物筛选技术的出现,意味着大批量的化合物可以在很短时间内快速地进行筛选。应用芯片技术对生物文

20、库进行药物筛选,其基本原理是在芯片或合成珠等固相表面上进行原位文库合成和筛选。 2.4.3 dna芯片在乙型肝炎病毒基因突变分芯片在乙型肝炎病毒基因突变分析中的应用析中的应用 乙型肝炎病毒乙型肝炎病毒(hbv)为一部分双链为一部分双链dna病毒，主要引起病毒，主要引起急、慢性肝炎急、慢性肝炎,部分反复感染的患者可发展成肝炎、肝硬部分反复感染的患者可发展成肝炎、肝硬化或肝癌。化或肝癌。hbv在复制过程中由于有逆转录过程的参与，在复制过程中由于有逆转录过程的参与，因而较其他因而较其他dna病毒更容易发生突变，目前研究较多且病毒更容易发生突变，目前研究较多且临床意义较为明确的突变是临床意义较为明确的

21、突变是hbv前前c区区1 896位、基本核位、基本核心启动子心启动子(bcp)区区1 762、1 764位以及聚合酶基因位以及聚合酶基因p区区528位、位、552位突变。位突变。 王永忠等应用膜显色王永忠等应用膜显色dna芯片法同时检测这些位芯片法同时检测这些位点突变点突变,实验结果显示，实验结果显示，hbsag+、hbeag+、hbeab-的患者病毒没有变异；的患者病毒没有变异；hbsag+、hbeag-、hbeab+的患者的患者hbv前前c区区1 896位、位、bcp区区1 762、1 764位变异较多；位变异较多；hbsag+、hbeag+、hbeab+的患者的患者hbv前前c区区1 8

22、96位变位变异低于异低于“小三阳小三阳”患者，而患者，而bcp区区1 762、1 764全部发生了变异。接受拉米夫定治疗全部发生了变异。接受拉米夫定治疗48周后周后hbvdna阳性患者中，阳性患者中，hbv p区基因变异较多区基因变异较多,实验结果表明实验结果表明,膜显色膜显色dna芯片法用于乙型肝炎芯片法用于乙型肝炎病毒基因突变分析，简便、快速、特异性好。病毒基因突变分析，简便、快速、特异性好。2.4.4 dna芯片用于肿瘤基因表达的芯片用于肿瘤基因表达的研究研究 dna芯片为研究肿瘤发生发展中的基因芯片为研究肿瘤发生发展中的基因开关及表达程度提供了强有力的工具，开关及表达程度提供了强有力的

23、工具，利用它可随时获取肿瘤细胞生长各期与利用它可随时获取肿瘤细胞生长各期与肿瘤生长相关基因的表达模式肿瘤生长相关基因的表达模式,因此基因因此基因芯片技术被大量用于肿瘤基因表达的研芯片技术被大量用于肿瘤基因表达的研究。究。derisi等应用等应用dna芯片技术检测了芯片技术检测了肿瘤抑制相关基因的表达肿瘤抑制相关基因的表达,把人把人6号染色号染色体转导入人黑色素瘤细胞株体转导入人黑色素瘤细胞株,该瘤的致病该瘤的致病性被抑制。性被抑制。 2.4.5 dna芯片在人白细胞抗原芯片在人白细胞抗原a19组基组基因快速分型中的应用研究因快速分型中的应用研究 血清学分型是人白细胞抗原血清学分型是人白细胞抗原

24、a位点位点(hla-a)的经的经典分型方法，而此方法的交叉反应，尤其是典分型方法，而此方法的交叉反应，尤其是hla-a19分裂子之间较强的交叉反应分裂子之间较强的交叉反应,及淋巴细及淋巴细胞膜抗原的弱表达，常常产生分型技术难点和胞膜抗原的弱表达，常常产生分型技术难点和判断误差，并直接影响器官移植效果。李成涛判断误差，并直接影响器官移植效果。李成涛等利用等利用dna芯片技术芯片技术,根据根据hla-a位点不同基因位点不同基因亚型的独特序列设计探针亚型的独特序列设计探针,制成分型芯片；待检制成分型芯片；待检测样品经聚合酶链反应测样品经聚合酶链反应(pcr)标记上荧光之后标记上荧光之后,与芯片进行杂

25、交与芯片进行杂交,根据杂交产生的荧光信号值，根据杂交产生的荧光信号值，分析确定样品分析确定样品a位点的基因亚型。位点的基因亚型。 2.4.6 dna芯片用于细菌分型芯片用于细菌分型v利用基因芯片技术对致病菌基因组利用基因芯片技术对致病菌基因组dna、rrna进行遗传分析进行遗传分析,从而能够计算出细菌种属从而能够计算出细菌种属间的遗传距离或者分析和判断菌体的毒性等。间的遗传距离或者分析和判断菌体的毒性等。有研究者建立了一张空肠弯曲菌基因组芯片有研究者建立了一张空肠弯曲菌基因组芯片,与与不同的致病菌基因组不同的致病菌基因组dna杂交杂交,结果显示被检结果显示被检测的测的11种致病菌基因组种致病菌

26、基因组dna中中21%基因没有杂基因没有杂交信号交信号,说明这些基因在被检细菌基因组中存在说明这些基因在被检细菌基因组中存在高度的差异性。高度的差异性。2.4.7 dna芯片在男科学研究中的应用芯片在男科学研究中的应用 睾丸是合成雄激素和产生精子的主要器官睾丸是合成雄激素和产生精子的主要器官,但是睾丸组但是睾丸组织的不同发育阶段及其内在的生精过程所表达基因的织的不同发育阶段及其内在的生精过程所表达基因的研究目前还知之甚少。研究目前还知之甚少。sha等利用人睾丸等利用人睾丸cdna文库构文库构建了含有建了含有9 216个克隆的人睾丸个克隆的人睾丸cdna芯片芯片,用于鉴别人用于鉴别人胚胎睾丸和成

27、人睾丸组织差异表达的基因谱胚胎睾丸和成人睾丸组织差异表达的基因谱,得到得到731个个在人胚胎睾丸和成人睾丸中差异表达的基因在人胚胎睾丸和成人睾丸中差异表达的基因,其中已知其中已知的基因是的基因是54个个,在这在这54个基因中个基因中18. 52%已被以前的研究已被以前的研究证实为精子发生所特有。这个结果也证实了用睾丸芯证实为精子发生所特有。这个结果也证实了用睾丸芯片鉴别睾丸功能相关基因的可行性。片鉴别睾丸功能相关基因的可行性。 2.4.8 dna芯片在法医学的应用芯片在法医学的应用 法医检验中可以用dna芯片分析snps位点,从而鉴定亲子关系和个人识别。美国nanogen公司研制出snps分析的主动式电磁dna芯片,可以在几分钟内完成检测,能适应法医检验的要求。gabriel等用27条探针的dna芯