WB实验基本步骤

1、实验基本步骤提取细胞蛋白BCA定量制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）蛋白样品变性电泳转膜封闭一抗TBST洗涤二抗TBST洗涤显影结果分析试剂配制1.PBS 磷酸盐缓冲溶液1L磷酸二氢钾0.24g磷酸氢二钠1.44g氯化钠8g氯化钾0.2g加入 500ml 纯水，调PH=7.2定容至 1L, 高压蒸汽灭菌2.PBST （ PBS+0.05% 吐温 -20 ）500mlPBS+0.25ml 吐温 -203. 电转液 500mlTris1.5g甘氨酸7.2g400ml 水溶解加入 100ml 甲醇，置于4冰箱预冷4. 电泳液（ 1X ）10x 稀释， 50ml10x 电泳液 +450ml 纯水5.TB

2、S6.TBST （ TBS+0.05% 吐温 -20 ）50mlTBS+450ml纯水 +0.25ml 吐温 -207. 封闭液TBST1X+5% 奶粉40ml 封闭液 =40mlTBST+2g奶粉， 40 预热WB 实验一、蛋白样品制备准备 :一管细胞， PBS（ 4预冷）， PMSF（100mM ），移液枪（ 1000ul ，10ul ）， 1.5mlEP 管 2 个，高速冷冻离心机 4预冷1.于 -20冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液2.加入 1ml 4 预冷的 PBS（0.01M pH7.2 7.3）。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4， 8000r 离心 5min，然后弃去上清。重复以上操

3、作一次，共洗细胞两次以洗去培养液。3.按 1ml 裂解液加10 l PMSF（ 100 mM ），摇匀置于冰上。 （ PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4.在样品中加入300ul 含 PMSF的裂解液，吹匀，于冰上裂解30 min ，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5.裂解完后，于4下 12000 rpm 离心 5 min。7.将离心后的上清分装转移倒0.5 ml 的离心管中放于20保存。二、蛋白含量的测定（BCA定量）准备： 96 孔板，移液枪（1000ul ， 10ul ，200ul）， BCA工作液（ A+B）， 50mlEP 管， 1xPBS， BSA标准液1.将 96

4、 孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用）2.算好孔数（总的） 每孔加 200ulBCA 工作液（ A+B），（ A 液：B 液 =50:1，一般配多些， 如 60 孔，A 液 12000ul ，B 液 240ul）3.将样品稀释到一定倍数才能定量，（10 倍， 20 倍， 30 倍），每孔需要20ul 样品（ 2ul 样品 +18ulPBS,即稀释 10 倍），做三个重复则需要60ul ，一般配80ul4.配蛋白标准样品，将2mg/ml 的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml ，若配 200ul 的 0.5mg/ml 蛋白标准溶液则需要 50ul 的 2mg/ml 的蛋白

5、标准溶液和150ul PBS 溶液5.将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按0，1,2,4,8,12,16,20ul 加到标号的区域，之后在加标准样品的孔内，将孔内溶液用PBS补足到 20ul6.每孔加 200ul 配好的工作液,平行加 ,不能上下加 ,以减少误差7.将加好的96 孔板放在 37下孵育 30 分钟8.孵育完后 ,放在酶标仪轻微震荡3-10s,中速 ,吸光值 595nm, 进行比色测定 ,记录标准曲线及样品吸光值数据后,以蛋白含量（ ml ）为横坐标 ,吸光值为纵坐标作标准曲线。（R2 0.98 才有用 ,酶标仪操作 :两个箭头图标,1 是结果 ,2 是保存）9.计

6、算蛋白含量（注意定量样品已经稀释了10 倍）蛋白质定量标准曲线加样量序号12345678标准蛋白量 /ul01248121620（ 0.5mg/ml ）背景液（ PBS） /ul2019181612840标准液浓度 mg/ml00.0250.050.10.20.30.40.5三、 SDSPAGE电泳1. 配胶（ 12%,可以提前配好）准备：玻璃板，梳子，AP（解冻，现拿现用），聚丙烯酰胺（4冰箱冷藏）（ 1）玻璃板验漏 5min（ 2）按表配置分离胶（ 3）灌胶，加酒精封压，凝 30min （注意不要有气泡）（4）按表配浓缩胶，倒掉酒精，用吸水纸吸去酒精，灌胶，插梳子（注意不要有气泡），凝30

7、min（5）取胶，用水冲洗一下浓缩胶，加少量水放入一次性手套中4冰箱保存备用2. 样品处理准备： PBS，移液枪， 1.5mlEP 管（1）稀释样品： 一般每孔上样5ul，即 1mg/ml 浓度的样品， 测完蛋白含量后，将样品用PBS稀释至 1mg/ml（注意 loadingbuffer 的加入也得算入）（2）取出上样样品15ul 至 1.5 ml 离心管中，加入6 SDS 上样缓冲液3ul 至终浓度为1。（上样总体积一般不超过15 l ，加样孔的最大限度可加20 l 样品。）（3）将样品在100煮 5 min 震荡使蛋白完全变性（注意仪器操作）3. 电泳准备：电泳液500ml（现配），蛋白胶

8、，10ul 移液枪（枪头），样品，Marker ，冰盒，电泳装置（ 1）将 SDS-PAGE 胶放入电泳槽中，加足够的电泳液。（短玻璃板面向内，长玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意先检漏。）（2）上样。用移液枪贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤 3 次，以免交叉污染。）（3）先设置80V，开始电泳，样品溴酚蓝跑至分离胶后增至120V电压，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜

9、。（此时准备好电转液）四、转膜准备：电转液（现配4冰箱冷藏），镊子，滤纸，PVDF膜（ 0.45um ），电转装置，冰盒注意：拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镊子，因为手上的蛋白会污染膜。1. 在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫2. 滤纸浸入电转液中，PVDF膜在甲醇中润湿成半透明，小心将膜放入4电转液中平衡至少5min。3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。4. 先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作

10、要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上（做好标记），用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。）3 张滤5. 将夹子放入转移槽中（电转移时会产热，浆槽放入冰中），要使夹的

11、黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。一般用 100mA 转移 90min 。6. 转完后将膜用 1丽春红染液染 5 min（于脱色摇床上摇） 。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。将膜晾干备用。（准备封闭液）六、免疫反应准备：封闭液，一抗，二抗，TBST1 .将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭2h。2. TBST洗 4 次。每次 5 分钟。3. 将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记，加入相对应的一抗，室温孵育2h 或者 4过夜4. 室温下孵育12 h 后，用 TBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min5.同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育12 h 后，用 TBST在室温下脱色摇床上洗4 次，每次 5 min七、显影准备：样品胶片，移液枪（200ul ），中枪头，吸水纸，显影液（A+B），薄镊子一抗二抗目的蛋白 78kd Bip 1:1000兔二抗75kd目的蛋白 34kd GAPDH内参 1:50