第十七章基因重组与基因工程geneticrecombinationand

1、第十七章第十七章 基因重组与基因工程基因重组与基因工程 (genetic recombination(genetic recombination and genetic engineering) and genetic engineering)基因重组基因重组 是指在体外用酶学方法将不同来源的是指在体外用酶学方法将不同来源的dnadna进行切进行切割、连接，组成一个新的割、连接，组成一个新的dnadna分子的过程，又称分子的过程，又称dnadna重组。重组。基因克隆基因克隆 将重组将重组dnadna分子导入到合适的受体细胞中，使其分子导入到合适的受体细胞中，使其扩增和繁殖，以获得大量的同一扩增

2、和繁殖，以获得大量的同一dnadna分子，称此为分子，称此为基因克隆、基因克隆、dnadna克隆或分子克隆。克隆或分子克隆。基因工程基因工程 实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为实现基因克隆所采用的方法和相关工作，统称为重组重组dnadna技术或基因工程。技术或基因工程。 本章主要内容本章主要内容 重要的工具酶重要的工具酶 基因克隆常用的载体基因克隆常用的载体 重组重组dnadna基本原理基本原理 重组技术在医学和制药重组技术在医学和制药 工业中的应用工业中的应用第一节第一节 重要的工具酶重要的工具酶工具酶工具酶 基因工程中的工具酶主要是指基因工程中的工具酶主要是指用用于于dnadna和

3、和rnarna分子的分子的切割、连接、聚合、切割、连接、聚合、修饰、反转录等修饰、反转录等有关的各种酶系统。有关的各种酶系统。一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶(re)(re) 是一类由细菌产生的能专一识别双链是一类由细菌产生的能专一识别双链dna中的特中的特定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键定碱基序列、并水解该点磷酸二酯键 的核酸内切酶，的核酸内切酶，简称简称限制酶限制酶或或切割酶切割酶。 根据根据限制酶的限制酶的作用特性，一般分为三类：作用特性，一般分为三类： 、和和型，型， 其中常用的是其中常用的是型限制酶型限制酶。 限制酶（限制酶（型）识别及切割位点型）识别及切割位点 特异识别及切

4、割特异识别及切割4 4 8 8个个bpbp长度且具有长度且具有回文序列回文序列的的dnadna片断，主要产生片断，主要产生3 3种缺口：种缺口： 5 5粘性末端粘性末端 3 3粘性末端粘性末端 平端或钝端平端或钝端 回文序列回文序列 是指该部位的核苷酸序列呈是指该部位的核苷酸序列呈180180o o旋转对称旋转对称; ; 粘性末端粘性末端 是指经内切酶特异切割后产生的是指经内切酶特异切割后产生的5 5末端突出或末端突出或3 3末端突出的碱基序列相互具有互补性末端突出的碱基序列相互具有互补性。 产生产生5-5-粘性末端粘性末端-g-cttaa53aattc-g-35-g-cttaa53aattc

5、-g-35+ecor i 产生产生3-3-粘性末端粘性末端-ctgca-g53g-acgtc-35-ctgca-g53g-acgtc-+pst i35 产生平产生平( (头末头末) )端端/ /钝端钝端5-ccc3-gggggg-3ccc-5+sma i5-ccc3-gggggg-3ccc-5其它特殊性质其它特殊性质的的型限制酶型限制酶同裂酶（同裂酶（异源同工酶异源同工酶）同尾酶同尾酶可变酶可变酶同裂酶同裂酶 又称异源同工酶。指来源不同，但具有又称异源同工酶。指来源不同，但具有相同的相同的识别识别序列序列。 在切割在切割dnadna时，其时，其切割点切割点可以是可以是相同相同的，产生的，产生平

6、头末端，称为平头末端，称为同识同切同识同切； 切割点切割点也可以是也可以是不同不同的，产生的，产生3 3或或5 5粘性末粘性末端，称为端，称为同识异切同识异切。 同裂酶同裂酶同识同识同同切切5-ttt3-aaaaaa-3ttt-5+aha dra 5-ttt3-aaaaaa-3ttt-5同裂酶同裂酶同识同识异异切切gccatggtaccgggtaccccatggggtaccccatgg+kpn i5-g3-ccatggtacc-3g-5+asp718 i5-3-3-55-3-3-55-3-3-5同同 尾尾 酶酶gcctaggatccggatcctaggatcctag5-3-3-5mbo bam

7、h bgl5-3-3-55-a3-tt-3a-5 同尾酶同尾酶 指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后性的一类酶。它们作用后产生相同产生相同的的粘性粘性末端末端。可变酶可变酶可变酶可变酶 识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，并且识别顺序往往超过并且识别顺序往往超过6 6个碱基对。个碱基对。 如，如， bstbstpp，其识别顺序为，其识别顺序为ggtnaccggtnacc。 常用限制性核酸内切酶的特性微生物名称微生物名称bacillus amyloliquefaciens h解淀粉芽孢杆菌解淀粉

8、芽孢杆菌bacillius globigil球芽孢杆菌球芽孢杆菌escherichia coli ry13大肠杆菌大肠杆菌haemophilus influenzae流感嗜血菌流感嗜血菌providencia stuartii 164普罗威登细菌普罗威登细菌streptomyces albussubspecies pathocidicus白色链球菌白色链球菌酶名称酶名称bamhbgl ecorhind pstsal识别顺序识别顺序ggatccacatctgaattcaagcttctgcaggtcgac同裂酶同裂酶bsthsusalp同尾酶同尾酶bgl mboavaxho二、二、dnadna聚合

9、酶聚合酶 （最常用的最常用的dnadna聚合酶有以下聚合酶有以下4 4种种） dnadna聚合酶聚合酶 dna dna聚合酶聚合酶大片段大片段klenowklenow片段片段 taq dnataq dna聚合酶聚合酶 t t4 4 噬菌体噬菌体dnadna聚合酶聚合酶 dnadna聚合酶聚合酶 e.coli e.coli dnadna聚合酶聚合酶（dna pol dna pol ） 是一个具有是一个具有3 3 种酶活性的多功能性酶。种酶活性的多功能性酶。包括：包括： 5 533dna dna 聚合酶活性聚合酶活性 5 533核酸外切酶活性核酸外切酶活性 3 355核酸外切酶活性核酸外切酶活性

10、dna pol dna pol 应用应用 催化催化dnadna缺口平移反应，制备高比活性缺口平移反应，制备高比活性dnadna 探针；探针； 第二条第二条cdnacdna链的合成；链的合成； 对对dna3dna3突出末端进行标记；突出末端进行标记； dna dna序列分析。序列分析。e. coli dna pol. 催化切口平移* t* t* t* tm g2 +d n a s e i5 3 3 5 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 d a t p ,d c t p ,d g t p -3 2p d t t pe . c o li d n a p o l i klenow

11、klenow片段（片段（dna pol.dna pol.大片断）大片断） klenowklenow片段用途片段用途 补齐双链补齐双链dnadna的的 3 3末端；末端； 用标记碱基补用标记碱基补 齐齐3 3末端末端 ； 聚合酶klenow dna -32pdntp双链dna粘端5-外切酶变性+5335353533555533标记探针标记末端 在在cdnacdna克隆中，克隆中， 用于第二股链用于第二股链 的合成；的合成； dna dna序列分析。序列分析。 taq dna poltaq dna pol（耐热（耐热dnadna聚合酶）聚合酶） 作用作用特点特点1 1） taq dna polta

12、q dna pol催化催化dnadna合成的最适温度范围合成的最适温度范围 70 70 7575，2 2） 9595以上高温，半小时不失活，以上高温，半小时不失活， 3 3） 最适合用于聚合酶链反应（最适合用于聚合酶链反应（pcrpcr）。）。 三、逆转录酶三、逆转录酶 特点特点 逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3 3种酶种酶活性：活性： 以单链以单链rna rna 为模板，为模板， 催化合成催化合成cdnacdna单链单链 具有具有rnase h rnase h 活性，能水解活性，能水解rna:dnarna:dna杂交链中的杂交链中的 rnarna

13、 以以dnadna为模板，催化合成为模板，催化合成cdnacdna双链。双链。 逆转录酶的应用：逆转录酶的应用： 将将mrnamrna逆转录成逆转录成cdnacdna，构建，构建cdnacdna文库；文库； 补平和标记补平和标记5 5- -末端突出的末端突出的dnadna片段；片段； 代替代替klenowklenow酶用于酶用于dnadna序列分析；序列分析； 制备杂交探针等。制备杂交探针等。四、四、dnadna连接酶连接酶(dna ligase)(dna ligase) dnadna连接酶可以连接酶可以 催化带有粘性末端或平头末端的催化带有粘性末端或平头末端的双链双链dnadna中一条链的中

14、一条链的3 3ohoh与另一条链的与另一条链的5 5popo3 3h h2 2形形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的dnadna长链。长链。 dnadna连接酶的用途连接酶的用途（1 1） 两个双链两个双链dnadna片段连接起来片段连接起来5 5- acg aattcgt-3- acg aattcgt-3 t t4 4dnadna连接酶连接酶 5 5-acgaattcgt-3-acgaattcgt-33 3- tgcttaa gca-5- tgcttaa gca-5 3 3-tgcttaagca-5-tgcttaagca-5（2 2） 修补带有缺口的

15、双链修补带有缺口的双链dnadna分子分子t4dna连接连接酶酶五、碱性磷酸酶五、碱性磷酸酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶(bap) (bap) 能够催化水解去除能够催化水解去除dnadna或或rna5rna5- -端的磷酸基团。端的磷酸基团。用途用途 制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5 5端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。组效率。 用用3232p p标记标记5-5-端前，去除端前，去除5-p5-p，再通过激酶作用，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到把放射性核苷酸加到5-5-端进行标记。端进行标记

16、。六、末端六、末端 （脱氧核苷酸）转移酶（脱氧核苷酸）转移酶(tdt)(tdt) 作用作用 将标记或未标记的将标记或未标记的dntpdntp加到加到dnadna的的3 3ohoh末端；也可催化末端；也可催化载体分子或待克隆的载体分子或待克隆的dnadna片断上加上互补的同聚尾，便于进一片断上加上互补的同聚尾，便于进一步连接。步连接。应用应用 探针标记探针标记 p32-.dgtpg32g32g32g32g32g32g32g32 在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接在载体和待克隆的片段上形成同聚物尾，以便于进行连接重要的工具酶重要的工具酶工具酶工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶

17、 t4 dnat4 dna连接酶连接酶 dnadna聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 t4t4多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶 活性活性 识别特异序列，切割识别特异序列，切割dna dna 催化催化dna5dna5- -磷酸与磷酸与3 3- -羟基羟基 形成磷酸二酯键形成磷酸二酯键 以以dnadna为模板合成为模板合成dna dna 以以rnarna为模板合成为模板合成dna dna 切除末端磷酸切除末端磷酸 催化核酸催化核酸5-5-羟基磷酸化羟基磷酸化第二节第二节 基因克隆常用的载体基因克隆常用的载体载体载体(vector)(vector) 是将外源是将外源dna(dna(目

18、的目的dna)dna)片断引入宿主细胞片断引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为的运载工具，其化学本质为dna dna 。 本节主要内容本节主要内容 载体必须具备的基本条件载体必须具备的基本条件 载体的种类载体的种类 常用的载体常用的载体一、载体必须具备的基本条件一、载体必须具备的基本条件 有自身的有自身的复制子复制子，能独立复制，能独立复制 具备多个限制酶的识别位点具备多个限制酶的识别位点( (多克隆位点多克隆位点) ) 具有具有遗传表型或遗传表型或筛选筛选标记标记 有有足够的容量足够的容量以容纳外源以容纳外源dnadna片段。片段。 表达型载体表达型载体还应具备与宿主细胞相适应的还应具备与宿

19、主细胞相适应的启动启动 子、前导序列、增强子子、前导序列、增强子等调控元件。等调控元件。 载体载体dnadna中均有一段中均有一段非必需区非必需区，将外源基因插入，将外源基因插入 该非必需区，而载体本身不受影响。该非必需区，而载体本身不受影响。二、载体的种类二、载体的种类*（一）（一） 克隆载体克隆载体 用来克隆和扩增用来克隆和扩增dnadna片段的载体，具有片段的载体，具有3 3点点共性共性： 能够在受体细胞复制；能够在受体细胞复制； 带有药物抗性基因，便于筛选；带有药物抗性基因，便于筛选； 可导入受体细胞。可导入受体细胞。（二）（二）表达载体表达载体 除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表

20、达构除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件件转录和翻译所必须的转录和翻译所必须的dnadna顺序。顺序。三、常用的载体三、常用的载体 （一）（一） 质粒质粒 (plasmid)(plasmid)： 是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链是存在于细菌染色体外的、能自主复制的双链环状环状dnadna分子。分子。 作为克隆载体的质粒应具备以下特点：作为克隆载体的质粒应具备以下特点： 1. 1. 分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内， 有较高的拷贝数有较高的拷贝数 2. 2. 具有具有1 1个以上的遗传标志，便于筛选个以上的遗传标志，便于筛选 3. 3.

21、具有多克隆位点具有多克隆位点 总而言之，质粒载体应该是一种分子量总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的较小、高拷贝的“松弛型松弛型”质粒，且具有一质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。广泛应用的质粒：广泛应用的质粒： pbr32质粒、质粒、puc系列等系列等 pbr322pbr322质粒质粒 4363 bp 4363 bp 含一个复制点含一个复制点含一个抗氨卞青霉素标含一个抗氨卞青霉素标 记记( (ampampr r) ) 一个抗四环素标记一个抗四环素标记 ( (tettetr r) ) ampampr r和和tettetr r基因内各基因

22、内各有一些限制酶的酶切位点，有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入供外源基因插入 当外原基因插入抗药当外原基因插入抗药基因位点时，基因位点时，ampampr rampamp敏敏感感( (ampamps s ) )、tettetr rtettet敏敏感感( (tettets s).).puc系列质粒系列质粒 由由pbr322pbr322和和m13m13噬菌体构噬菌体构建而成的双链质粒载体；建而成的双链质粒载体；（1 1） 2674bp2674bp；（2 2） 有有ampampr r和与和与m13m13噬菌体噬菌体 相同的多克隆位点（相同的多克隆位点（mcsmcs）（3 3）有一个来自大肠杆菌的）

23、有一个来自大肠杆菌的laczlacz操纵子的操纵子的dnadna片断片断, , 编编码半乳糖苷酶码半乳糖苷酶 ( (二二)噬菌体噬菌体 组成特点组成特点： 双链线状双链线状dnadna分子，分子， 全长全长50kb50kb， 含含6565个基因，个基因， 在其分子两端各含有在其分子两端各含有1212个碱基的互补单链，是个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为天然的粘性末端，被称为coscos位点。位点。 噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长 溶菌性生长（溶菌性生长（lytic pathwaylytic pathway） 噬菌体感染细菌后，借助其噬菌

24、体感染细菌后，借助其2 2个个coscos位点互补位点互补成环成环，在宿，在宿主菌体内主菌体内连续复制连续复制，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，颗粒，裂解宿主菌裂解宿主菌，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。 溶源性生长溶源性生长(lysogenic pathway)(lysogenic pathway) 噬菌体感染细菌后，可将自身噬菌体感染细菌后，可将自身dnadna整合整合到细菌的染色体到细菌的染色体中去，与之中去，与之一起复制一起复制，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解解 。

25、噬菌体两种生长途径（示意图）噬菌体两种生长途径（示意图） 第三节第三节 重组重组dnadna基本原理基本原理 （dnadna重组基本程序包括下列过程）重组基本程序包括下列过程） 分分获取目的基因和载体获取目的基因和载体 接接目的基因与载体的连接目的基因与载体的连接 转转重组重组dnadna导入宿主细胞导入宿主细胞 筛筛重组重组dnadna的筛选与鉴定的筛选与鉴定1 1、获取、获取ttttaaaa质粒外源dna分子ttaattaaaattecor iecor iaatt dnadna重组基本过程重组基本过程2 2、重组、重组ttttaaaaligasettaattaaaatt“退火”aatt3

26、3、转化、转化转化到宿主细胞中(如e. coli)宿主细胞染色体dna重组质粒重组质粒4 4、筛选、筛选筛选含有重组质粒的菌株宿主细胞染色体dna重组质粒含有外源dna的“工程菌”5 5、克隆、克隆含有外源dna的“工程菌”繁殖/扩增6 6、表达、表达表 达 产 物 分 离 纯 化表达产物分离纯化表达产物分离纯化一、目的基因的获取（一、目的基因的获取（分分）目的基因目的基因 是指所要研究或应用的基因，也是需要克是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。隆或表达的基因。 目的基因来源目的基因来源 1 1） 制备基因组制备基因组dnadna 2 2） 制备制备cdnacdna 3 3）

27、聚合酶链反应聚合酶链反应 4 4） 人工合成基因人工合成基因（一）制备基因组（一）制备基因组dnadna（基因（基因文库）文库）分离、纯化基因组分离、纯化基因组dnadna 条件：条件：温和，在温和，在edtaedta或或sdssds等存在下等存在下 rere 用蛋白酶用蛋白酶k k消化细胞、酚抽提消化细胞、酚抽提大小不同酶切片段大小不同酶切片段 片段分离：片段分离：常用蔗糖梯度或电泳分离常用蔗糖梯度或电泳分离 分别与同样分别与同样rere消化的载体连接消化的载体连接 常用噬菌体载体或质粒载体常用噬菌体载体或质粒载体 dna dna连接酶连接。连接酶连接。 导入细胞导入细胞 进入宿主细胞内培养

28、扩增。进入宿主细胞内培养扩增。 筛选鉴定筛选鉴定 用分子杂交、凝胶电泳用分子杂交、凝胶电泳 等方法鉴定。等方法鉴定。 （二）制备（二）制备cdnacdna （cdnacdna文库）文库）（1 1）合成）合成cdnacdna第一条链第一条链 反应体系只有反应体系只有mrnamrna、逆转录酶、逆转录酶、4 4种种dntpdntp、引物。、引物。引物是与引物是与mrna3mrna3端端 polyapolya互补的寡聚互补的寡聚dtdt（121218dt18dt片段）片段）（2 2）合成）合成cdnacdna第二条链第二条链 rnasernase去掉模板去掉模板mrnamrna（3 3）构建）构建c

29、dnacdna文库文库cdnacdna两端加接头或衔接头两端加接头或衔接头接头接头是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。衔接头衔接头是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。cdnacdna与载体相连。与载体相连。导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存cdnacdna集合体便是集合体便是cdnacdna文库。文库。（二）制备（二）制备cdna （cdna文库）文库） 分离目的基因分离目的基因 的的mrnamrna逆转录生成

30、逆转录生成cdnacdna单链单链 水解去除水解去除mrnamrna， 合成合成cdnacdna双链双链 水解回折处单链水解回折处单链得到平端双链得到平端双链cdnacdna导入宿主细胞克隆导入宿主细胞克隆, ,构建构建cdnacdna文库文库（三）聚合酶链反应（三）聚合酶链反应( pcr)( pcr) 在模板在模板dnadna、引物、引物、dntpdntp、taqdnataqdna聚合酶等条件下，聚合酶等条件下，体外经体外经9494变性、变性、5454退火及退火及7272延伸延伸3 3个步骤的反复多个步骤的反复多次循环（次循环（2525 3030次次），扩增目的基因（见），扩增目的基因（见1

31、818章）。章）。 （四）人工合成基因（四）人工合成基因 引用引用dnadna测序仪测出某一基因的碱基序列，或测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用再用dnadna合成仪通过化学合成原理合成目的基因。合成仪通过化学合成原理合成目的基因。 一般先合成短片断一般先合成短片断dnadna，然后再拼接成长片段。，然后再拼接成长片段。 二、二、 目的基因与载体的连接（目的基因与载体的连接（接接） （主要有以下（主要有以下4 4种连接方式）种连接方式） 1) 1) 粘性末端连接粘性末端连接 2 2） 平头末端连接平头末端连接

32、 3 3） 人工接头法人工接头法 4 4） 同源多聚尾连接法同源多聚尾连接法 （一）（一） 粘性末端连接粘性末端连接 将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生将目的基因和载体用同一种限制酶酶切，产生 相同粘性末端，再通过相同粘性末端，再通过dnadna连接酶作用将两者连接起连接酶作用将两者连接起来，构成重组来，构成重组dnadna分子。分子。 （二）平头末端连接（二）平头末端连接 某些限制酶只能将目的基因和载体某些限制酶只能将目的基因和载体dnadna切割成切割成平端，此时在平端，此时在t t4 4dnadna连接酶的作用下同样能连接起连接酶的作用下同样能连接起来。来。（三）（三） 人工接头法

33、人工接头法 合成连接子合成连接子与与dnadna平头末端连接平头末端连接限制酶切割限制酶切割, ,产生粘性末端产生粘性末端连接，构建重组连接，构建重组dnadna。（四）同源多聚尾连接法（四）同源多聚尾连接法三、重组三、重组dnadna导入宿主细胞（导入宿主细胞（转转） 无性繁殖无性繁殖 体外重组后的体外重组后的dnadna导入受体细胞，形成转化子。然导入受体细胞，形成转化子。然后随受体细胞生长、增殖，使重组后随受体细胞生长、增殖，使重组dnadna发生复制、扩增，发生复制、扩增，这一过程称为无性繁殖。这一过程称为无性繁殖。克隆克隆 从上述无性繁殖细胞中进一步筛选出含目的从上述无性繁殖细胞中进

34、一步筛选出含目的dnadna的的重组体分子即为无性繁殖系或克隆。重组体分子即为无性繁殖系或克隆。宿主细胞宿主细胞 进行无性繁殖时所采用的受体细胞进行无性繁殖时所采用的受体细胞. . 重组重组dnadna导入宿主细胞的类型导入宿主细胞的类型转化转化 以以质粒质粒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转染转染 以病毒以病毒作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；转导转导 以以噬菌体噬菌体作载体构建的重组体导入受体细胞的过程作载体构建的重组体导入受体细胞的过程。 感受态细胞感受态细胞 用特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源用

35、特殊方法处理后，受体细胞才具备接受外源dna的能力，的能力， 这种细胞称这种细胞称感受态细胞感受态细胞。 感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。 四、重组四、重组dna的筛选与鉴定（的筛选与鉴定（筛筛）（筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法） 1） 平板筛选平板筛选 2） 限制酶切图谱筛选限制酶切图谱筛选 3） pcr筛选重组体筛选重组体 4） 原位杂交技术原位杂交技术插入失活插入失活蓝白筛选蓝白筛选（一）（一） 平板筛选平板筛选 是指利用载体的遗传性标记直接筛选的方法。 如，具有抗药性标记的载体，转化宿主细

36、胞后，能在含抗生素（amp或tet）的培养平板上生长；未转化的则不能生长。1. 插入失活 当外源dna序列插入质粒中某一抗药基因内，使该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的培养平板上。 抗生素平板筛选抗生素平板筛选（插入失活插入失活）（2 2）蓝蓝- -白白筛选筛选 它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选它是一种利用蓝色化合物的形成作为指示剂的筛选方法，筛选含有编码含有编码-半乳糖苷酶的基因。半乳糖苷酶的基因。 载体：载体：编码编码-半乳糖半乳糖 宿主：宿主： 编码编码-半乳糖半乳糖 苷酶苷酶n端端序列序列 苷酶苷酶c c端端序列序列 - -互补互补细菌表达：细菌表达：

37、 -半乳糖苷酶活性蛋白半乳糖苷酶活性蛋白5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚（吲哚（ x-gal） 形成形成蓝色菌落蓝色菌落 当在质粒中插入外源当在质粒中插入外源dna-dna-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的n n端基因失活端基因失活不能与宿主不能与宿主-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的c端端进行进行-互补互补产生产生白色菌落白色菌落。 （iptg 存在下）存在下） 蓝蓝白白筛选筛选示意图示意图2. 2. 限制性内切酶图谱鉴限制性内切酶图谱鉴3. pcr3. pcr筛选重组体筛选重组体 抽提少量重组抽提少量重组dnadnapcrpcr扩增扩增电泳鉴定电泳鉴定序列分析。序列分析。4. 4. 原位杂交技术原

38、位杂交技术 五、重组体在宿主细胞中的表达和调控五、重组体在宿主细胞中的表达和调控 基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。质产品。 克隆基因表达有三个条件克隆基因表达有三个条件 基因的编码区不能被插入序列所中断基因的编码区不能被插入序列所中断; ; 基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主基因转录要有启动子，而启动子必须能被宿主 细胞的细胞的rnarna聚合酶有效地识别聚合酶有效地识别; ; mrna mrna必须相当稳定，并有效地被翻译，产生的外必须

39、相当稳定，并有效地被翻译，产生的外 源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。源蛋白质必须不为宿主细胞的蛋白酶所降解。第四节第四节 重组技术在医学和制药工业中的应用重组技术在医学和制药工业中的应用 一、疾病基因的发现一、疾病基因的发现 19901990年年美国科学家首先启动美国科学家首先启动人类基因组计划人类基因组计划（hgphgp），），计划历时计划历时1515年，至年，至20052005年完成；年完成； 20012001年年2 2月月1212日日由由sincesince和和naturenature杂志同时向世界杂志同时向世界宣布，人类基因组宣布，人类基因组3x103x109 9bpbp的最新

40、图谱，约含的最新图谱，约含3 3 4 4万个万个基因；基因； 整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。但要揭示人类但要揭示人类4 4万个基因功能的任务将更为艰巨。万个基因功能的任务将更为艰巨。 人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。类疾病相关基因提供了参照模板。 如，已知人类遗传性疾病约有如，已知人类遗传性疾病约有30003000种，推测可种，推测可能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。能是由于某些基因结构异常或基因位移等突变所致。如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常如果利用分子生物学技术，将患者疾病基因与正常基因图谱作对照分析，必将有助于阐明