水稻雄性不育突变体gamyb5的鉴定与基因定位

1、中国水稻科学(Chi nJR i ceS ci ) ,( ) :ht t p :/ / w w w ricesci cnD OI:/j 水稻雄性不育突变体ga myb 的鉴定与基因定位杨正福 ,张迎信 ,孙廉平 ,张沛沛轩丹丹 刘嶺,胡霞李紫荷 占小登 吴玮勋 曹立勇 , ?程式华 , ?( 中国水稻研究所/ 国家水稻改良中心 / 浙江省超级稻研究重点实验室,杭州沈阳农业大学农学院 , 沈阳; 河南农? 通讯联系人; 业大学 农学院 ,郑州; 共同第一作者;,Emai l:caolioncaas cn,s hc henmail hz z cn)yggjI denti fi cat i ona

2、ndG eneMai ngofMal eS t eri l eMut antga mbi nR i ceppyY A NG Zhe n fu, ,Z H A N G Yi n xi n, ,S U N Li ani ng, , Z H A N G Pei ei ,X U A N Dandan, L I U Li n, ,H Uggp, ?p, ?gXi a, L I Zihe,Z H A N Xi aoden,W U Wei x un , C A O Li on, C HE N G Shi huaNat i onalCent erorR i ce I mgKeLabor at ororZhe

3、i anySugi ceR esear chChi naNati onalRi ceR esear ch I nsti t ut efprov e menty fgperR(/yj,H an gz hou , Chi n a ; Col l ege ofAg rono my,Shen y ang A gr i cul t uralU ni versi t y, Sheny an g , Chi na ; Col l ege ofA gr ono my ,HenanA ri cul t ur alUni versi ty ,Zhengz hou,Chi naT heseaut hors cont

4、ri but ede ual lyt ot hi s wor k;g;qCorr espondi nga ut h orEmai lc aol iyongcaas cnshchengmai lhz z cn?,:;j)Y A NGZ hen f u ,ZHA NGYi nxi n,SU NLian i ng,etal Identi fi cati onandgenemai nofmal es t eri l emut antggpppgg amybi n rice Chi n JR i ceS ci, , () : Abst r act : T he,asidentifi edfr omt h

5、emut antli brarofCotr eat eda ol l enfreemal es t eril emut antwga m bpyi ndi cayT herewas no si gnificantdif f er ence i na grono mi c t r ait s sucha s pl ant t ype ,c ulti varZhong huil antheightpand till ernu mberbet ween g a myb and t hew il dty pe Butg a myb ex hi bit ed sl enderandwhit e ant

6、her sw it houtmat urep oll en gr ai ns Obser vat i onresult so fant hercr osssect ionsex hi bit edt hat t hemi crospor emot herc ell sfail edtofor mf uncti onalt et r ads andm i cr osores i ng a mybMoreover, t aet alcell s ofg amybabnor mallyenl ared and t he t aet u mppgppr ora mmed cel l deat h(PC

7、D ) was del a ed , as t hepoll ena cce t or ,was cr ossedw it h t hew il d teZ honhuig,yg amy bpy pg andaj a p onicacul tiv arresecti velyGeneti canalysisofa llhybri dizati onpopul ati onsindi cat edthatg amyb waspgenewcont r oll edb y a si ngl e recessi ven ucl earhi chw asm a pp edon t he l ong ar

8、 mo f chr o moso me Wit hdevel oedS S R , I ndelmar kers andF mai ngpopul at i ono f/ , t heenewas fi nemaed t o a r e i ono fpppg amy bgppgk bo n t he l on g ar mo fchr o moso mebet weenmar k er s Z FandZ FSequence anal ysis of t he t wo open r eadi ngf r ames i n t hi s r e i onr eveal edthatt heL

9、 OC_Os,whi che ncodesai bber ell i ninducedMY Btranscriti on, hada ngggpf act ornucl eoti des bases del et i on i n t he seconde xt r onr obablyresonsi bl e f or t hemal e st eri lityphenote ,ppy pAdditi onallyr ealti mefl uorescentquanti t at ivePCR analysi sshowedthattheex r essi onlevelofthei mor

10、t antT DRCY PB i napi ng a mybT oget herpregul at or s U D T ,CYPA andnt herdecreaseds i g nif icant l y,t heseresul t s suggestGAM YBpl aysk ey r ol es i na nt hermei osis and t apet u m PCD Keywor ds:ri ce;mal e st eril ity;genema i ng;ga mybpp杨正福 , 张迎信 , 孙廉平 ,等 水稻雄性 不育突变体 ga my b的鉴定与基因定位 中国水稻科学,(

11、) :射线辐射诱变籼稻中恢的突变体库内发现了一个无 花 粉 型 雄 性 不 育 突 变 体 ga my bg a my b的 株摘要: 在.Co无差异 , 而其花药细长且呈白色半透明状, 花药中无花粉粒.花药半薄切片型 、株高 、分蘖数等农艺性状与野生型中恢观察结果表明,a m b, 没有形成正常的四分体和小孢子,并且绒毡层异常伸长,细胞程序性的小孢子母细胞减数分裂异常死亡延迟 .gy为母本 , 与野生型中恢明 ,ga my b对以 ga my b和广亲和粳稻品种分别配制的杂交组合遗传分析表杂交的 F突变性状受一个隐性核基因控制.利用 ga myb和定位群体,最终将突变基因精细定位于第染色体长

12、臂的和ZF两个标记之间,物理距离约k b. 对该区域内个完整的开放阅读框测序分析发现, 编码受赤霉素 诱ZF,导致翻译提前终止.检测到影导的MY B转录因子基因的第外显子存在个碱基的缺失L OC _Osgq RTP CR响花药发育的调控因子UDT TDRCY PA和CY PB 的表达量在突变体中比野生型中极显著降低.进一步证明GA MYB、.在花药减数分裂和绒毡层细胞程序性死亡过程中起关键作用关键词 :水稻 ;雄性不育 ;基因定位 ; ga my b:文章编号 :中图分类号:Q; S文献标识码A()收稿日期 :;修改稿收到日期:.:基金项目农业部农业公益性行业科技专项(, ) ;国家转基因重

13、大 专 项 (Z X); 浙江省自然科学基金资助项目 (、水稻杂种优势机理研究创新团队项目 (CAASASTI PQC) ; 中国农业科学院创新工程超级稻育种创新团队CN RRI ) ; 国家自然科学基金资助项目() . msp 突变体产生过量的中国水稻科学(第卷第期 (年月)Chi nJR i ceS ci )水稻雄性生殖发育是一个复杂的生物学过程,也是水稻繁衍后代和产量形成的关键过程. 首先,雄蕊原基的三层细胞经过数轮细胞分裂和分化, 形成由四层体细胞包围着花粉母细胞的花药结构. 这四层体细胞由外到内依次为表皮层、内皮层中间层和绒毡层 经过减数和有丝分. 其次花粉母细胞裂最终形成三核花粉粒

14、. 最终花药开裂散粉, 至此整个雄性生殖发育过程完成.水稻因其经济上的重要性以及较小的基因组 ,成为了分子生物学和功能基因组学研究的单子叶模式植物 . 目前 , 已克隆了超过个水稻隐性核雄性不育基因 . 根据不育基因的功能和表达时期的差异 , 可将水稻隐性核雄性不育基因大致分为调控小孢子母细胞发育 、减数分裂 、绒毡层发育 、小孢子和花粉外壁发育以及花药开裂等相关的不育基因.MS P(Mul ti pl eS por ocyt e ) 是 水 稻 中 第 个 克隆的早期调控小孢子细胞发育的基因, 它编码富含亮氨酸的受体蛋白激酶雌雄孢子母细胞, 花粉囊细胞壁和绒毡层发育紊乱,小孢子母细胞发育停留

15、在减数分裂期 , 而大孢子母细胞的发育不受影响, 最终导致花粉彻底败育 PAI RPai ri ngAber r ati on I n Ri ce.()系列基因PAI R PAI R和PAI R参与减数分裂中同源染、ZE PZeax ant hi n E poxi 色体联会 配对.(都是调控水稻减数分dase) ME L PSS、裂的基因 .已克隆的调控水稻花药绒毡层发育的育性基因 TDR(T a pet u mDegener ati on Ret ar dati on) UDT(Undevel oped T a pet u m) 、GAM YB PT C(Persi st entT apet

16、 alC el l 、)和 API (A p opt osi sI nhi bi t or ) 等转录因子, 主要调控花药绒毡层的过程和花粉粒的形成过PC D程 . 还有一类基因与小孢子花粉壁蜡质角质等物质形成有关 , 该类基因突变致使花粉囊和花粉外壁发育受阻 ,导致花粉败育.例如: WDAWaxDe i (f 和 D PWci entA nt her )(Def ect i veP ol l enWal l), 花粉粒皱缩退化突变体花粉囊蜡质显著减少, 导致花粉 败 育 C Y PB 和 CYPA 都 属.基因家族,在脂肪酸的羟基化过于细胞色素P程中起重要作用, 表明脂肪酸羟基化在植物雄配子

17、体发育和孢子体发育过程中的角质合成和花粉粒外壁形成中发挥重要作用.AI D(Ant herIndehi scenceGene ) 控制水稻花药的开裂和花粉的育性 . ai d 突变体 中 花药 不 开 裂、花 粉发 育 异 常 , 引起雄性不 育、 . GAM YB 是大麦糊粉层中赤中的同源基因已克隆霉素依赖的淀粉酶转录正调控因子.在水稻中 ,GAM Y B 除了影响糊粉层和花粉囊发育过程中淀粉酶的表达 , 还调控绒毡层降解的过程和花粉发PC D育过程 ,是水稻花粉发育早期所必需的转录因子.但水稻雄配子体发育过程和调控机制并未被完全探明 , 对控制 ga my b 突变体雄性不育基因 的定 位

18、与克隆有助于更全面地水稻雄配子体发育的分子机制 , 为雄性不育株系进行育种应用提供理论基础和基因资源 .本研究通过辐射诱变籼稻品种中恢Co, 从其后代中分离鉴定出一个无花粉型雄性不育突变体 g a myb , 对 其 进 行表 型 鉴 定 和基 因 定 位等研究 , 并筛选出候选基因 , 为进一步研究该基因功能和探究其育种应用潜力提供理论基础.材料与方法试验材料籼型水稻 恢复系中恢Co辐射诱变 ,( Z H) 经在其后代中鉴定出一个无花粉型雄性不育突变 体 ga myb,通过挖稻桩的方式进行繁殖.所有亲本材料于年夏种植于中国水稻研究所实验基地 ,种植与管理同大田生产.遗传分析及定位群体的构建以

19、突变体ga m b为母本,分别以野生型中恢y和广亲和常规粳稻品种为父本 , 配制杂和交组合 ; 观察的表型 , 分单株收获种子 .在BCF F 和群体统计无花粉型与正常野生型的BCF F 所有材料分离比例,用于遗传分析和基因定位.年种植于 中国水稻研究所杭州富阳实验基地,种植与管理同大田生产.和海南陵水基地花粉育性调查抽穗期当日开花前,取野生型和突变体的颖花并套自交袋, 每株个重复 , 挂牌标记 ,用染色镜检 ,IKI拍照并计算典败、圆败 、染败 、正常花粉粒比率 .成熟期摘取自交袋室内考种, 计算结实率 .ga m b突变体花药的半薄切片观察y取野生型和突变型不同发育时期的小花, 于固定液(

20、V 甲醛 V 冰乙酸 V 乙醇 F A A)中固定 , 利用真空泵缓慢抽气, 近真空状放置, 缓慢放气至样品全部沉底,换用新的F A A , 固定 h;经梯度酒精脱水后于树脂预渗透Tec hn ovi t 杨正福等:水稻雄性不育突变体g a myb 的鉴定与基因的精细定位表 精细定位和测序引物Tabl e Ma ker s used f or f i nem ap pi ng and se quenci ng 引物名称上游引物Pr i mern a meFor w ar d pri mer( )RDGCT TGTGGCAAT TGGGZFGAT CAT ACCAT CAT CA GA AGCA

21、GTZFT CT CGCT CC T C T T CGCCCA A A CZFGGCAGCA GCAAT CACA ACACZFC A GCC A GGC AC CGCA GC A A AZFGC A CGCT T CT C GC T A CGCT ATZFT GGGT GC GA GGT T T CT GT GAI n Del C A A CCCC T CCA A A T A CC T GAGAMY BACT GGAGCA CT GCT GA TCTT CcD NAC CC CT GC GA GT CC AA T C T A C下游引物实验目的Reverse pr i mer()Pur po

22、se精细定位CGCCT GA T GG AT GT C G精细定 位 Fi nem appi n gCA A GCA GC CC AC AT CA CA GC精细定位Fi nem appi n gAC CC GC AC CA GT AC GT GA CCCFi nem appi n g精细定位TCGGCACT TT CT T T ACTCA ACT精细定 位 Fi nem appi n gAAGAA AGGCAGAGCA AGAAGG精细定位Fi nem appi n gGCTCCAGGAACACCACCA ACT CFi nem appi n g精细定位AATGA AT GCGT GT TT

23、 CCTGTFi nem appi n g精细定位ACCGTGTT CATGCCTT TCACFi nem appi n gGCACAT CT TCTCAGTT GCCA G位 点检 测g a my b del et i ons it ed et ecti ong a myb测序ACCGGCT T AT CT CCAT GCACc D N Ac D N As equenci ng液中静置h, 再 于 树脂渗 透 液 中静 置h; 后 于包埋板中聚合,恒温箱中烘烤左 右 .dLei ca半薄切片机上横切花药,切片厚度为R M m ,甲苯胺蓝染色后用Lei caD光学显微镜观察拍照 .MD NA

24、的提取和基因定位用 简 易提取法 分单株提取组合D N A的中突变型单株利 用本g a my b/ F DNA .实验室保 存 的对标记 和对 SSRI n Del标记 检测中恢和之间的多态性,选对多态引物取平均分布于水稻条染色体上对株突变型单株进行染色体连锁分析及初步定位 .根据:/ / w w w ra mene or) 中Gr a mene (httpg公布的粳稻g日本晴和籼稻的全基因组序列,用间内的基因组序软件对比初定位区DNAST AR列,寻找插入 / 缺失 (Pr e mI n Del ) 位点 , 利用 Pri meri ers 软件设计新的分子标记 , 对突变基因( 表I n

25、Del进行精细定位) .所用引物由杭州擎科梓熙生物技术有限公司合成.扩增采用北京鼎国昌盛生物技术有限责PC R反应体系: 模板任公司的 LDN A L ,PCR缓冲液T aq L , Primer ( mol / L ) L ,d N T P L,酶程序如 L,dd H O L ;PC R下 :下预变性下下 变 性 mi n ; s, 退火下延伸s , 共 个循环 ; 最后s ,下延伸扩增产物经非变性聚丙 mi n . PC R烯酰胺凝胶电泳 ,染色 、甲醛和Na O H显色 . A g N O候选基因分析从水稻基因组注释计划数据库(ht t p :/ / r apdb dna aff rc

26、o ) 中查阅位于精细定位区间内的所有gj p开放阅读框(OR F ) , 并分析可能的候选基因. 根据候选基因的全长基因组序列, 设计测序引物D N A( 由上英潍捷基贸易有限公司合成) , 分别对突变体ga myb 和野生型中恢的候选基因进行PCR扩增并 测序,扩增采用高保真聚 合 酶PCRD N AK ODPl usNeo , 反应体 系 及反 应条件 参照 说明 书 . 产物送往 杭州擎科梓熙生物技术有限公司测PCR软件拼接,并使用序,测序结果由中的Conti g Ex pr ess进行序列比对,确定突DNASTARMeg Ali gn变位点 . 实时荧光定量PCR 分析用公司包含去基

27、因组酶的逆转录试TOYOBO剂盒 (DNA Snt hesi sK i t ) , 提 取Fi rstS t r an dc长花序时的花药总y为反c m链RNA.以 Oli go (d T )转引物进行第合成 , 反应体系及反应条c D N A分析调控件参照说明书 .利用实时荧光定量PC RUDT花药育性的关键基因 MSP TDR、CY PA C YPB 以及 突变 基因 GAM YB在、野生型和突变体中的表达量. 内参基因为RUBQ登录号为( GenBank体 系 (NM_) .实时荧光定量)包括蒸馏水、PCRLL SYB RqPC R Mi xL 、上下游引物(mol / L )各、模板,

28、 每个样品个重复. LLc D N A下下下扩增程序为s; PCR下s,s,个循环 .s,结果与分析突变体表型分析突变体ga m b及其野生型中恢在株高 、y分 蘖等株型性状和穗部表型上无明显差异( 图A中国水稻科学(第卷第期 (年月)Chi nJR i ceS ci )中恢和突变体ga myb的植株 ;B 中恢和突变体 ga myb 的穗部表型;中恢和突变体ga my b 的颖花形态 ;中恢A ga my b.的花粉育性 .C D 和突变体的花药表型中恢和突变体 g amybE A , Pl a nt of Zh on g hui an d t he ga myb mut an t at t

29、 he headi ng st age ; B , Pa ni cl e ofZho ng hui a nd t he gamyb mut ant ; C , Spi kel et oft hew il d t yp eZho ng huianda m b ;D ,A nt hero fZ h on g huian dga m b mu ta nt ; E ,Pol l enfer ti li t y ofZ h ong huiandga mybg yy图野生型中恢 ( WT ) 与突变体ga my b抽穗期的表型比较Fi g Phenot y pi c co mp ari so n ofwi

30、l d t y peZ h onghui ( WT )a nd a m b gyC ),但是野生型的花药饱满呈黄色,而突变体的花药瘦弱呈白色 ( 图D).花粉镜检结果显示,野生型中 恢的花粉粒全部被染 成 深I KI色 , 育性正常 , 而突变体ga m b花药经染色压片,y并无花粉粒释放出来, 完全败育.突变体遗传分析以 ga myb 突 变 体 为 母 本 , 广 亲 和 粳 稻 品 种和野生型中恢为父本, 配制杂交组合,分别统计其植株花粉育性和小穗育性正常.F 表突变体 ga my b 的遗传分析Tabl e Gen eti c a nal ysi s oft he ga myb mut

31、 ant 结实率组合F Seedsetti ngCr ossr at e of F / ga my b/ga my b中恢 ga myb/ Z ho ng hui 中恢/ Zho ng hui 和群体中的野生型和突变型植株数, 经卡BCFF 的分离比值(表方检验 , 均符合) ,同时还统杂交计了野生型中恢和结实率, 在F ,其分离群体中并没有发现无花粉型雄性不育植株这表明 g a my b突变性状受核隐性单基因控制.目的基因的初定位和精细定位为定位 ga myb 雄 性不 育 基因 , 选取 平均 分布于条染色体上的对多态引物对株突变型单株进行染色体连锁分析及初步定位. 连锁分析发F 野生型植

32、株数突变体植株数 N u mber ofN u mber ofwil d t y pe pl ant smut ant pl ant s杨正福等:水稻雄性不育突变体g a myb 的鉴定与基因的精细定位突变基因的初步定位;突变基因的精细定位;精细基因定位区间中的预测基因;候选基因的结构及其在A B C D L OC _Osg突变体中的突变位点(个碱基缺失 ) .A , Pr eli mi n ar y map pi n g ofga m b; B , Fi n em ap pi ng ofga m b; C , Pr edi cti o no f t he ca ndi dat e g enewit hi n t h e f i nemap ped r e gi o n ; D , T heyystr uct u r e of ca ndi dat e g en eL OC _Osgand t h emut ati ons i t e i n ga myb mut ant(bases del et ed