生物絮凝剂高产菌株的选育

1、第34 卷第3 期2004 年9 月工业微生物industrial microbiologyvol. 34 no. 3 sept . 2004基金项目:福建省青年科技人才创新项目(编号2002j044) 和厦门大学自选课题作者简介:何宁(1974) ,女,博士,讲师。联系电话:0592 - 2183088 ; e - mail : hening xmu. edu. cn生物絮凝剂高产菌株的选育何宁1 , 吴海军2 , 邓旭1 , 卢英华1 , 孙道华1 , 李清彪1(1. 厦门大学化学工程与生物工程系,厦门361005 ; 2. 亨氏美味源食品有限公司,广州511483)摘要以野生菌谷氨酸棒杆

2、菌corynebacterium gl utamicum cctcc m201005 为出发菌株,进行紫外和甲基磺酸乙酯逐级诱变,获得一株絮凝剂高产菌xmu2yh1111 ,通过条件优化实验,获得突变株xmu2yh1111 合成生物絮凝剂的最佳发酵条件:葡萄糖为碳源,尿素和酵母膏为氮源,培养基初始ph 48 ,种子最佳种龄16 h ,接种量5 % ,发酵罐通风量1 l/ (l·min) ,搅拌转速100r/ min。在此发酵条件下,絮凝活性最高可达到892 u/ ml ,比原出发菌株cctcc m201005 的絮凝活性提高2 倍以上。关键词: 生物絮凝剂; 谷氨酸棒杆菌; 诱变;

3、发酵生物絮凝剂因其无毒无害、可生物降解等优点,在废水处理、食品工业、化工及生物制药等行业具有广泛的应用前景。然而,产量低、成本高仍然是目前限制生物絮凝剂在实际应用中进行推广的主要问题1 。近年来,国内外学者为提高生物絮凝剂产量、降低成本,先后在微生物絮凝剂产生菌的筛选、发酵条件优化等方面进行了广泛研究,但效果并不显著,提高产量仍然是生物絮凝剂研究者目前首要解决的问题1 ,2 ,3 。在前期的研究工作中,作者从土壤中筛选得到的一株谷氨酸棒杆菌( corynebacterium gl utam2icum) cctcc m201005 ,该菌能够以葡萄糖或蔗糖为碳源合成一种以半乳糖醛酸为主要结构单元

4、的新型生物絮凝剂rea2114 ,5 。为提高该菌株合成rea211 的产量,本文尝试采用传统的物理化学诱变方法来对原有的絮凝剂产生菌株进行改造,以期从根本上提高菌株合成絮凝剂的能力,获得絮凝剂高产变异株。1 材料和方法1. 1 菌种corynebacterium gl utamicum cctccm201005 ,保藏于武汉中国典型培养物保藏中心。1. 2 培养基1. 2. 1 斜面培养基(g/ l)葡萄糖5 ,酵母膏1 ,牛肉膏1 ,胰蛋白胨2 ,硫酸亚铁微量,琼脂1520 。1. 2. 2 种子培养基(g/ l)葡萄糖10 ,酵母膏0. 5 ,磷酸二氢钾0. 1 ,尿素0. 5 ,氯化钠

5、0. 1 ,七水硫酸镁0. 2 。1. 2. 3 发酵培养基(g/ l)碳源10 ,氮源1 ,磷酸二氢钾0. 1 ,氯化钠0. 1 ,硫酸镁0. 2 。1. 2. 4 筛选培养基(g/ l)邻苯二甲酸二丁酯(dbp) 10 (ml) ,酵母膏0. 5 ,磷酸二氢钾0. 1 ,尿素0. 5 ,氯化钠0. 1 ,七水硫酸镁0. 2 。以上培养基ph 均为8. 0 。1. 3 培养方法1. 3. 1 种子培养于新鲜斜面取一环菌,接入种子培养基(100ml/ 250 ml 三角瓶) ,28 ,120 r/ min 振荡培养16h 。1. 3. 2 摇瓶培养将培养16 h 的种子液以5 %(v/ v)

6、的接种量接入发酵培养基(100 ml/ 250 ml 三角瓶) ,28 ,120r/ min 振荡培养48 h 。1. 3. 3 小罐分批培养 7 以5 %(v/ v) 的接种量将种子培养液接入装有2 l 发酵液的3 l 发酵罐中, 通气量为1 l/ (l ·min) , 搅拌转速100 r/ min ,28 ,溶氧在线自动检测。1. 4 诱变方法1. 4. 1 紫外诱变方法于新鲜斜面取一环菌接入种子培养基( 100ml/ 250 ml 三角瓶) ,28 、120 r/ min 培养16 h ,离心收集菌体,用无菌生理盐水洗涤菌体三次,制成菌体浓度约为107 个/ ml 的单细胞菌悬

7、液,将此单细胞菌悬液于紫外灯下照射60s 后,按5 %的接种量接至发酵培养基中,28 、120 r/ min 暗室培养过夜,按稀释法涂布于筛选平板上,28 恒温培养至菌落生长良好,挑取菌落进行筛选。1. 4. 2 甲基磺酸乙酯( ems) 诱变方法于新鲜斜面取一环菌接入种子培养基( 100ml/ 250 ml 三角瓶) ,28 、120 r/ min 培养16 h ,离心收集细胞,用无菌生理盐水和0. 1 mol/ l 磷酸钾缓冲溶液(ph 7. 0) 各洗涤一次后,将打散的菌体悬浮于含有10 g/ l 甲基磺酸乙酯( ems) 的0. 1 g/l 磷酸钾溶液(ph 7. 0) 中,28 振荡

8、处理1 h 。取10 ml 处理后的菌悬液用0. 16 mol/ l 硫代硫酸钠溶液稀释10 倍终止反应,离心收集菌体,用无菌生理盐水洗涤后接入新鲜的种子培养基中进行后培养。最后取后培养液按十倍稀释涂筛选平板,从筛选平板上挑取菌落较大的进行初筛、复筛。1. 5 测定方法1. 5. 1 絮凝活性测定方法取40 ml 1 %(g/ l) 的高岭土溶液加至50 ml刻度试管中,再依次加入2. 5 ml 1 %(g/ l) cacl2溶液和1 ml 待测样品,蒸馏水加至满刻度,充分混合后,迅速到入比色杯中,静止5 min 后, 于550 nm处测定吸光度。以空白培养基代替待测样品做对照。絮凝活性以絮凝

9、率表示,f. r. = (b - a) / b ×100 ×d ;a :待测样品的od550值,b :空白培养基的od550值,d :发酵液稀释倍数。1. 5. 2 菌体干重将含有4 ml 发酵液的塑料离心管置于台式高速离心机( tgl216g) 中,于10000 r/ min 下离心10min ,去上清液,105 烘至恒重。2 结果与讨论2. 1 菌种诱变2. 1. 1 紫外诱变出发菌株c. gl utamicum cctcc m201005 经过紫外诱变,经初筛获得32 株絮凝剂合成能力较出发菌株有所提高的变异菌株,其中有11 株菌的提高幅度在10 %以上。对这11 株

10、菌做进一步复筛,发现其中只有3 株菌在两轮的复筛过程中能够维持比较高的絮凝稳定性,而其他8 株菌的絮凝剂合成能力均出现不同幅度下降。基于此,作者选择絮凝活性提高幅度最大的菌株xmu2yh11 作为二次诱变的出发菌株,该菌株的絮凝剂产量比出发菌株提高了15. 6 %。2. 1. 2 甲基磺酸乙酯( ems) 诱变为了获得更高的突变率,进一步提高絮凝剂产量,在紫外诱变的基础上,对菌株xmu2yh11 继续利用化学诱变剂进行第二次诱变。经过初筛和复筛操作, 最后挑选出6 株絮凝活性比cctccm201005 提高20 %以上的变异株。对这6 株高产菌做进一步复筛,同时考察它们在连续传代过程中合成絮凝

11、剂的稳定性。结果发现,经过二次诱变后,尽管某些菌株的絮凝剂合成能力不是非常稳定,但总体而言,菌株合成絮凝剂的能力均得到显著提高。突变株xmu2yh1111 和xmu2yh1119 在传代过程中絮凝剂产生能力强且稳定,而其余4 株菌在传代3 次后,絮凝剂产生能力均下降了20 %左右。综合考虑絮凝剂产生能力和遗传稳定性,作者确定xmu2yh1111 为研究用菌株,该菌株絮凝活性最终达到560 u/ ml ,比出发菌株cctcc m201005 提高了大约30 %。2. 1. 3 诱变前后菌株形态的变化比较诱变前和诱变后絮凝剂产生菌菌体细胞形态,在显微镜下可以清楚地看到二者在细胞形态上存在较为明显的

12、差别(图1) 。相对而言,诱变前的菌株较长而细,大多呈八字形,细胞多成簇,着色不均匀。而诱变后的高产菌株较短且粗,细胞分散而且着色均匀。据此,作者初步推测,絮凝剂产量不同,产生菌细胞形态也有所不同,二者之间可能存在一定的相关性。 8 第3 期工业微生物第34 卷图1 显微镜下观察诱变前后菌株细胞形态比较(10 ×100)kurane 在研究生物絮凝剂noc21 时也曾发现6 :当以葡萄糖和蔗糖为唯一碳源时,发酵过程中菌株rhodococcus erythropolis 细胞比较短小,此时发酵液的絮凝活性也较低,而当以果糖为唯一碳源时,细胞则变得很长,发酵液的絮凝活性也很高。他指出,这

13、种细胞的加长现象是同絮凝剂的合成同时发生的,细胞形态的变化是其胞内代谢发生变化的反映,这一现象表明该菌株的细胞形态与絮凝剂的合成可能存在极为密切的关系。可以设想,如果能将菌株形态与产物产量的相关性用于絮凝剂高产菌株的筛选工作中,不失为一个简单快捷的絮凝剂高产菌株检测方法。2. 2 絮凝剂高产菌株xmu2yh1111 的发酵条件优化2. 2. 1 种子生长条件优化分别对不同种龄的种子和不同的接种量(1 %10 %) 对xmu2yh1111 生长和絮凝剂合成的影响进行了考察,结果表明,种龄为16 h 时,最终细胞干重及絮凝剂活性均达到最高,分别为1. 8 g/ l 、565u/ ml 。镜检发现,

14、16 h 的种子细胞粗壮,大小均匀,表明菌体正处于生长旺盛期。5 %为该菌株的最佳接种量,此时,菌体干重和絮凝活性亦达到最大。2. 2. 2 xmu2yh1111 合成絮凝剂的营养与环境条件优化2. 2. 2. 1 最佳碳源的确定在各种水溶性碳源中(葡萄糖、果糖、蔗糖、乙酸钠、乳糖、淀粉) ,葡萄糖、蔗糖和果糖发酵所得絮凝活性最高。相比而言,这三种碳源对xmu2yh1111细胞生长和絮凝剂的合成均能起到促进作用(数据未显示) 。以1 %葡萄糖为碳源的絮凝剂合成过程和xmu2yh1111 细胞生长曲线如图2 所示。图2 以葡萄糖为碳源,xmu2yh1111细胞生长及絮凝剂合成曲线2. 2. 2.

15、 2 最佳氮源的确定图3 不同氮源对xmu2yh1111 细胞生长及絮凝剂合成的影响当以尿素作为发酵培养基的组成之一时,添加 9 第3 期何宁,等:生物絮凝剂高产菌株的选育第34 卷酵母膏似乎比添加玉米浆更有利于促进絮凝剂的合成(图3) ,这是与原出发菌株cctcc m201005 不同之处。因此, 选择尿素和酵母膏作为xmu2yh1111 发酵合成絮凝剂的最佳氮源组成。2. 2. 2. 3 发酵培养基初始ph 对絮凝剂合成的影响每种微生物的生长代谢都有其最适ph 值,ph对菌体生长和代谢产生重要的影响。实验结果表明,发酵培养基初始ph 在48 的范围内对xmu2yh1111 合成絮凝剂几乎没

16、有大的影响,只有当ph升高到11 以上时,絮凝活性才开始出现较为明显的下降(图4) 。图4 培养基初始ph 对xmu2yh1111 合成絮凝剂的影响2. 2. 2. 4 3 l 小型发酵罐上通风量对絮凝剂合成的影响作者在大量的前期实验中发现 7 ,发酵体系的溶氧水平直接影响cctcc m201005 细胞生长和絮凝剂的合成,由于在摇瓶中难以实现溶氧水平的调节,因此,作者在3 l 小型发酵罐上考察了不同通气量对xmu2yh1111 菌体生长和絮凝剂合成的影响(表1) 。结果表明,尽管细胞生长并无显著变化,发酵体系过高的通气量却会导致絮凝活性的显著降低。在维持通风量1 l/ (l·min

17、) ,搅拌转速100 r/min 的情况下,絮凝剂产量出现大幅度上升。可见,偏低浓度的溶氧水平更有利于xmu2yh1111 合成絮凝剂。这一点在理论上也可以得到很好的解释:由于谷氨酸棒杆菌合成的絮凝剂是以半乳糖醛酸为主要结构单元的高分子活性产物,因此该絮凝剂分子在胞内主要通过己糖醛酸支路进行合成8 ,该合成途径不需要消耗太多的能量,当发酵体系溶氧水平过高时, 细胞进行有氧呼吸, 代谢流主要进入emp2tca 循环途径,最终使流向产物合成支路的代谢流量减少,进而影响絮凝剂的合成;溶氧水平降低,不仅能够减小三羧酸循环的代谢流量,还可减少某些小分子类代谢副产物的合成(如乙酸, 乳酸等) 7 ,从而使

18、更多的代谢流量转向目的产物絮凝剂的合成。同时,由于己糖醛酸的合成所需能量较低,因此,在较低的溶氧水平下,即使三羧酸循环及电子传递链流量较小,也可通过底物水平磷酸化产生atp 来满足己糖醛酸合成的需要。表1 3 l 小型发酵罐上通气量对xmu2yh1111菌体生长和絮凝剂合成的影响通气量l/ (l·min) 细胞干重(g/ l) 絮凝活性(u/ ml)0 1. 85 8961 2. 00 8922 1. 80 6504 1. 80 590经过以上对xmu2yh1111 合成絮凝剂发酵过程参数优化,获得该絮凝剂的最佳发酵条件:葡萄糖为碳源,尿素和酵母膏为氮源,培养基初始ph 为48 ,种

19、子最佳种龄16 h ,接种量5 % ,发酵罐通风量1 l/ (l·min) ,搅拌转速100 r/ min。在此发酵条件下,最终絮凝剂活性最高可达到892 u/ ml ,比原出发菌株cctcc m201005 产生的絮凝活性提高2 倍以上。3 结论( 1 ) 以野生菌株c. gl utamicum cctccm201005 为出发菌株,采用紫外和甲基磺酸乙酯逐级诱变,获得一株絮凝剂高产菌株xmu2yh1111 ,该菌株的絮凝活性比原出发菌株提高了30. 2 %。可见,采用传统的物理化学诱变方法获得絮凝剂高产菌株是一条非常有效的途径。(2) 通过条件优化实验,获得突变株xmu2yh11

20、11 合成生物絮凝剂的最佳发酵条件:葡萄糖为碳源,尿素和酵母膏为氮源,培养基初始ph 48 ,种子最佳种龄16 h ,接种量5 % ,发酵罐通风量1l/ (l·min) ,搅拌转速100 r/ min。在此发酵条件下,最终絮凝剂活性最高可达到892 u/ ml ,比原出 10 第3 期工业微生物第34 卷发菌株cctcc m201005 产生的絮凝活性提高2 倍以上。参考文献1 kurane r , hatamochi k, kakuno t , kiyohara m , hirano m ,taniguchi y. production of a bioflocculant by

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