碳青霉烯类抗生素敏感性下降肺炎克雷伯菌耐药机制及分子流行病学研究

1、【细菌耐药性研究】碳青霉烯类抗生素敏感性下降肺炎克雷伯菌耐药机制及分子流行病学研究裘莉佩1 ，常燕子1 ，孙珺1 ，魏泽庆2 ，周华2 ，俞云松2( 1 宁波医疗中心李惠利医院，浙江宁波 315040; 2 浙江大学医学院附属第一医院，杭州 310003)摘要 目的: 研究临床分 离 对碳青霉 烯类抗生素敏感性下降 肺炎克雷伯菌 的 耐 药机 制及同源性分析。方法: 收集对碳青霉烯类抗生素敏感性下降肺炎克雷伯菌 25 株。e test 法测定 10 种抗菌药物的 mic 值; 脉 冲场凝胶电泳分析菌株同源性; pcr 及克隆测序分析耐药基因型。结果: 25 株菌株对 内酰胺类抗生素 呈多重耐药

2、，但对多黏菌素 e 和替加环素敏感。pfge 分型除一株外均为同一克隆 ( 暗示医院内感染) 。25 株菌株均产 kpc 2 碳青霉烯酶基因，并同时携带 ctx m、shv、dha 等多种耐药基因。结论: 携带 kpc 2 基因的肺炎克雷伯菌同时携带多种耐药基因。此类菌株对碳青霉烯类抗生素敏感性下降并对除多黏菌素e 和替加环素外抗生素多重耐药。关键词 肺炎克雷伯菌; 脉冲场凝胶电泳; 分子流行病学中图分类号 r378 99 + 6文献标识码 b文章编号 1004 8685( 2012) 06 1420 03study on the antibiotic resistance mechanism

3、 and the molecular epidemiology of klebsiel-la pneumoniae with reduced susceptibility to carbapenemsqiu li pei1 ，chang yan zi1 ，sun jun1 ，wei ze qing2 ，zhou hua2 ，yu yun song2( ningbo medical centre li hui li hospital，ningbo 315040，china)abstract objective: to investigate antibiotic resistance mecha

4、nism and clonal relatedness of klebsiella pneu-moniae with reduced susceptibility to carbapenems methods: 25 strains of klebsiella pneumoniae with reduced sus- ceptibility to carbapenems were collected the minimum inhibitory concentrations of these strains to 10 kinds of an- tibiotics were examined

5、by e test the homology of these isolates was analyzed by pulse field gel electrophoresisthe encoding gene of lactamases were analyzed by pcr and verified by dna sequencingresults: all strains ofklebsiella pneumoniae were multi resistant to lactam antibiotics，while susceptible to colistin and tigecyc

6、linethey were classified into the same clone ( suggest nosocomial infection) except one based on pfge pattern all of the 25 strains produced carbapenemases which were confirmed as kpc 2 by pcr and sequencing these isolates with positive kpc 2 also carried other resistance genes such as ctx m，shv，dha

7、 conclusion: all of the positive kpc 2 klebsiella pneumoniae carried other resistance genes these strains were low susceptibility to car- bapenems and multi resistant to other antibiotics except colistin and tigecyclinekey words klebsiella pneumoniae; pulsed field gel electrophoresis; molecular epid

8、emiology地均有报道，甚至出现流行6。这些菌株的出现常使抗感染治疗陷入无药可用的境地，患者病死率很高。本院 也自 2008 年临床标本分离出第一株耐亚胺培南肺炎克雷伯菌，本研究共收集 25 株非重复株，以分析其耐药机制及同源性，阐明其分子流行病学特征。随着临床上抗 菌药物特别是第 3 代头孢菌素的广 泛使 用，产 esbls 的 肠 杆 科 细 菌 不 断 增 加，其 耐 药 水 平 也越来越高。碳 青 霉 烯 类 抗 生 素 被 认 为 是 为 数 不 多 的 可有效治疗高 产 ampc 酶 和 esbls 的 肠 杆 菌 科 细 菌 引 起严重感染的药物之一。同样，随着碳青霉烯类抗生

9、素 的大量使用，细菌也逐渐获得对此类药物的耐药性。自1998 年，美国1首次发现产 kpc 2 型碳青霉烯酶肺炎 克雷伯菌，其后，法国、中国、以色列、英国2 5 等世界 各1 材料与方法1 1 菌株来源收集宁波医疗中心李惠利医院临床分离、非重复的 碳青霉烯类 抗生素敏感性下降肺炎 克 雷 伯 菌 25 株，入 选标准: 亚 胺 培 南 mic 值 2 g / ml。所 有 菌 株 均 经 生 物梅 里 埃 公 司 api 鉴 定 条 20e 重 新 鉴 定。大 肠 埃 希 菌基金项目 浙江省卫生厅科研基金资助项目( 200708479)作者简介 裘莉佩 ( 1974 ) ，女，硕 士 研 究

10、生，副 主 任 技 师，主要从事细菌检验和耐药性研究。atcc25922 和大肠埃希菌 atcc35218 作为药敏质控菌。1 2 主要试剂与仪器api 鉴 定 条 及 m h 琼 脂 购自生物梅里 埃 公 司，e test 条购自瑞典 ab biodisk 公司，分子量标准、taq 酶均 来自大连宝生物工程有限公司，pcr 引物由上海生工公 司合成，质粒抽提试剂盒 为 德国 qiagen 公 司 产 品，序 列分析在上海 英 骏 公 司 进 行; pcr 仪 为 美 国 pe 公 司 产 品，脉冲电泳 仪 chef xp 和 凝 胶 成 像 仪 均 为 美 国 bio- rad 公司产品。1

11、 3 药物敏感性测定采用浓度梯度法( e test) 检测亚胺培南( imp) 、美罗 培南( mem) 、头孢他啶( caz) 、头孢西丁( fox) 、哌拉西 林 / 三唑巴坦( tzp) 、头孢哌酮 / 舒巴坦( cps) 、环丙沙星 ( cip) 、阿米卡星( amk) 、多粘菌素 e( cst) 和替加环素 ( tgc) 10 种 抗 菌 药 物 的 mic 值。多 粘 菌 素 e 根 据 文 献7以 4 mg / l 为折点判定耐药或敏感。替加环素结果根据 fda 的肠杆 菌 科 判 定 标 准 mic 2 mg / l 为 敏 感。其他抗菌药物结果按 2010 年临床实验室标准化

12、研究所 ( clinical and laboratory standardinstitute，clsi) 的 临 界 值8判定敏感、中介、耐药。2结果2 1 药敏试验结果本研究所收集 25 株肺炎克雷伯菌对亚胺培南和美 罗培南的 mic 值均在 4 32 g / ml 之间，其中有 8 株 菌株的 mic 值为 4 或 8 g / ml，根据 2010 年 clsi 的判定 标准，虽落在敏感或中介范围，但确证产碳青霉烯酶，无 需解释8; 所有 菌 株 对 头 孢 他 啶、头 孢 西 丁、哌 拉 西 林 / 三唑巴坦( tzp) 、头孢哌酮 / 舒巴坦及环丙沙星均 100% 耐药; 而对氨 基

13、 糖 苷 类 抗 生 素 阿 米 卡 星，不 同 菌 株 有 不 同的耐药性; 未发现对多粘菌素 e 和替加环素耐药的菌 株( 见表 2) 。表 2 10 种抗菌药物对 25 株碳青霉烯类抗生素敏感性下降肺炎克雷伯菌体外抗菌活性( g / ml)抗生素名称mic50mic90mic 范围ipm 亚胺培南12324 32mem 美洛培南16324 32caz 头孢他啶fox 头孢西丁tzp 哌拉西林 / 三唑巴坦 cps 头孢哌酮 / 舒巴坦 cip 环丙沙星amk 阿米卡星cst colistin 多粘菌素 e tgc tigecycline 替加环素25625664 256128256256

14、32320 50 7525625625632640 751 532 256 256 256 323 2560 38 10 38 1 5脉冲场凝胶电泳( pfge)将培养过夜的 细 菌 调 成 4 个 麦 氏 浊 度 与 2 % 低 熔 点 琼脂糖 1 : 1 等量混合，制备琼脂糖块 ，蛋白酶 k 消化24 h，限制 性 内 切 酶 xba 37 酶 切 24 h，电 泳 条 件 :14 ，6 v / cm，线性变化 4 s 40 s，22 5 h，分子量标记 物为 ladder。电泳后 eb 染色 20 min，紫外 灯 观 察 结 果。1 5 pcr 扩增筛选 内酰胺酶耐药基因及测序包括 k

15、pc、ctx m、tem、shv 及 dha 酶基因。煮 沸法制备 pcr 模 板，引 物 合 成、反应条件参照 文 献9。 引物序列见表 1。pcr 产物送上海英骏公司测序。结果 在 genbank 网上查询。1 42 2 染色体 dna 同源性10pfge 分型参照 tenover 进行: 酶切图谱差异 3 个条带以上者为不同 的 类 型，3 个条 带以下为同一型中不 同亚型。本研究 pfge 图显示 25 株菌株除一株为克 隆 b 外，其余均是同一克隆 a( 见图 1) 。表 1 pcr 引物序列引物序列kpc p1kpc p2ctx m 1 p1ctx m 1 p2ctx m 9 p1

16、ctx m 9 p25' gctacacctagctccaccttc 3'5' acagtggttggtaatccatgc 3'5' ggcccatggttaaaaaatcactgc 3'5 cagcgcttttgccgtctaag 3'5' gttacagcccttcggcgatgattc 3'5' gcgcatggtgacaaagagagtgcaa 3'989944877tem p15' tcggggaaatgtgcg 3'972tem p25' tgcttaatcagtgagg

17、cacc 3'shv p15' gcctttatcggccttcactcaag 3'8981 7、9 14 为克隆 a，8 为克隆 b，m 为分子量标记图 1 部分菌株 xba酶切 pfge 图2 3 耐药基因型shv p2dha p1dha p25' ttagcgttgccagtgctcgatca 3'5 ctgatgaaaaaatcgttatc 3'5 attccagtgcactcaaaata 3'78025 株肺炎克雷伯菌 pcr 扩增 kpc 2 基因均阳性。目的片断长充( bp)同样星星之 火 可 以 燎 原，作 为 细 菌 室

18、 从 业 人 员，一 旦 发现此类高耐菌株，应迅速与临床、院感科联系，切实做好 各项预防措施，防止耐药克隆株的播散流行。pcr 产物经克隆测序与 genebank 上 kpc 2 的 序 列 完全一致 ( genebank 登 录 号 为: ay210886 ) 。pcr 扩 增 测 序同时显示所有菌株均携带 esbl s 基因( 包括 blatem 123 株、blactx m 1 14 株、blactx m 9 1 株或 blashv 12 7 株) ，其 中 4 株同时携带 ampc 基因( bladha 1 ) 。参考文献1 smith moland e，hanson nd，herre

19、ra vl，et al plasmidmediated，carbapenem hydrolysing lactamase，kpc 2，in klebsiella pneu- moniae isolatesj j antimicrob chemother，2003，51 ( 3 ) : 711 7142 naas t ，nordmann p ，vedel g，et al plasmidmediated arbapenem hydrolyzing lactamase kpc in a klebsiel lapneumoniae isolate from francej antimicrob age

20、nts chemother，2005，49 ( 10 ) : 4423 44243 张幸国，杜小幸，张 嵘，等 发 现 一 株 产 kpc 2 型 碳 青 霉 烯 酶 肺 炎克雷伯菌j 中华检验医学杂志，2006，29( 9) : 824 8264 leavitt a，navon venezia s，chmelnitsky i，et al emergence ofkpc 2 and kpc 3 in carbapenem resistant klebsiella pneumoniaestrains in an israeli hospital j antimicrob agents chemo

21、ther，2007，51( 8) : 3026 30295 woodford n，zhang j，warner m，et al arrival of klebsiella pneumoni- ae producing kpc / carbapenemase in the united kingdomj j anti- microb chemother，2008，62( 6) : 1261 12646 bratu s，landman d，haag r，et al rapid spread of carbapenem risistant klebsiella pneumoniae in new y

22、ork city: a new threat to our antiotic armamentariumj arch intern med，2005，165( 12) : 1430 14357 gales ac，reis ao，jones rn contemporary assessment of antimi- crobial susceptibility testing methods for polymyxin b and colistin: re- view of available interpretative criteria and quality control guideli

23、nesj j clin microbiol，2001，39( 1) : 183 1908 clinical and laboratory standards institute performance standards for antimicrobial susceptibility testing: m100 s20 u clsis wayne，pa，usa，20109 wei zq，du xx，yu ys，et al plasmid mediated kpc 2 in a klebsiella pneumoniae isolate from chinaj antimicrob agent

24、s che- mother，2007，51( 2) : 763 76510 tenover fc，arbeit rd，goering rv，et al interpreting chromosom- al dna restriction patterns produced by pulsed field gel electropho- resis criteria for bacterial strain typingj j clin microbiol，1995，33( 9) : 2233 223911 裘莉佩，潘登，徐炜烽，等 宁波地区鲍曼不动杆菌 16srrna 甲基 化酶基因研究j 中

25、国卫生检验杂志，2009，19( 3) : 615 61612 裘莉佩，潘登，徐炜烽，等 鲍曼不动杆菌碳青霉烯酶基因型及分 子流行病学研究j 中 华 流 行 病 学 杂 志，2007，28 ( 4 ) : 381 38413 汤 瑾，李 卿，蒋 燕 群 对肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶的研究 进 展j 检验医学，2010，25( 1) : 63 6614 clinical and laboratory standards institute performance standards for antimicrobial susceptibility testing: m100 s20 u clsis

26、wayne，pa，usa，2011( 收稿日期: 2012 02 15)3讨论碳青霉烯 类抗生素是临床 用 来 治疗重症感染的首 选抗生素之一，因为在所有 内酰胺类抗生素中，碳青霉烯类抗菌 谱 最 广，抗 菌 活 性 最 强，其 对 革 兰 阴 性 菌 产 生的超广谱 内 酰 胺 酶、ampc 酶 都 很 稳 定。然 而 随 着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，细菌也逐渐获得对此 类药物的耐药性，临床上常见的为铜绿假单胞菌和不动 杆菌属细菌，而 在 肠 杆 菌 科 细 菌 中 并 不 常 见3，11，12。然 而自 1998 年美国 首 次 分 离 出 一 株 产 kpc 2 型 碳 青 霉 烯酶肺炎克 雷 伯 菌 后，世 界 各 地 均 有 报 道，甚 至 出 现 流 行1 6。肠杆菌科对碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要 是由于产生 了 碳 青 霉 烯 酶。碳 青 霉 烯 酶 是 指 能 够 水 解 亚胺培南或美罗培南的一类 内酰胺酶，它包括 amb-