推荐4PCR技术

1、12pcr技术技术(1)概念：在概念：在_快速扩增快速扩增_的实验技术称为的实验技术称为pcr技术。技术。(2)物质条件物质条件体外进行体外进行dna复制的各种组成成分有：复制的各种组成成分有：_、_、_、_。(3)pcr的反应过程的反应过程pcr一般经历三十多次循环，每次循环可以分为一般经历三十多次循环，每次循环可以分为_和和_(72 左右左右)。体外体外特定基因或特定基因或dna序列序列(目的目的dna片段片段)dna模板模板四种四种脱氧核苷酸脱氧核苷酸taq聚合酶聚合酶引物引物变性变性(94 )、退火、退火(4060 )延伸延伸34细胞内细胞内dna复制与体外复制与体外dna扩增扩增(p

2、cr技术技术)的比较的比较1细胞内细胞内dna复制复制pcr不不同同点点解旋解旋解旋酶，边解旋边复制解旋酶，边解旋边复制80100 高温解旋，高温解旋，双链完全分开双链完全分开酶酶解旋酶，解旋酶，dna聚合酶，聚合酶，dna连接酶连接酶taq聚合酶聚合酶引物引物rnadna或或rna能量能量atp不加不加温度温度体内温和条件体内温和条件高温高温子链子链合成合成一条链连续一条链连续(先导链先导链)，另一条，另一条链不连续，先合成片段，再链不连续，先合成片段，再由由dna连接酶连接连接酶连接(滞后链滞后链)两条子链均连续合成两条子链均连续合成5相相同同点点提供提供dna模板模板四种脱氧核苷酸作原料

3、四种脱氧核苷酸作原料子链延伸的方向都是从子链延伸的方向都是从5端到端到3端端6引物引物设计原则设计原则1、引物决定着扩增的特异性和扩增的效率、引物决定着扩增的特异性和扩增的效率2、引物设计影响到后续载体构建的效率、引物设计影响到后续载体构建的效率3、引物设计影响到实验的成本、引物设计影响到实验的成本引物设计软件引物设计软件 primer premier 4.11 oligo 6.07数量数量：2个（一对）个（一对）长度长度一般在一般在1630个核苷酸个核苷酸，至少为，至少为16个核苷酸，不超过个核苷酸，不超过38个个指与模板链完全配对的碱基数指与模板链完全配对的碱基数太短太短：特异性差：特异性

4、差太长太长：自身折叠形成二级结构；：自身折叠形成二级结构；tm过高，不利于与模板稳固配对，难以形成扩增起始二级结构。过高，不利于与模板稳固配对，难以形成扩增起始二级结构。8顺序顺序应是所要应是所要扩增基因特异的顺序扩增基因特异的顺序若要进行个体间的比较，若要进行个体间的比较，应选择保守同一的顺序来设计引物应选择保守同一的顺序来设计引物碱基组成碱基组成gc为为4060atgc最好随机分布最好随机分布9防止引物自身形成二级结构防止引物自身形成二级结构 一对引物的顺序不应自身互补一对引物的顺序不应自身互补 特别要避免特别要避免3-端的重叠，以免形成二聚体等特异的扩增条带端的重叠，以免形成二聚体等特异

5、的扩增条带防止发卡结构防止发卡结构 、茎环结构、茎环结构 ！10 下图为某一次循环的产物，请据图回答问题。下图为某一次循环的产物，请据图回答问题。【巩固巩固1 1】 (1)pcr一般要经历三十多次循环，每次循环可分为一般要经历三十多次循环，每次循环可分为_、_、_三个步骤。三个步骤。(2)dna的羟基的羟基(oh)末端称为末端称为_，图中所示的羟，图中所示的羟基端为基端为_(填字母填字母)。(3)pcr技术与细胞内技术与细胞内dna复制在解旋时原理不同：细胞复制在解旋时原理不同：细胞内复制利用内复制利用_使双链间氢键断裂，而使双链间氢键断裂，而pcr技术利用技术利用_原理，使双链氢键断裂。以引

6、物为标识，可判断原理，使双链氢键断裂。以引物为标识，可判断出此产物最早为第出此产物最早为第_次循环的产物。次循环的产物。11聚合酶链式反应聚合酶链式反应(pcr技术技术)是体外酶促合成特异是体外酶促合成特异dna片段片段的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一的一种方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的个周期，循环进行，使目的dna得以迅速扩增，其简要过程如下图得以迅速扩增，其简要过程如下图所示。下列关于所示。下列关于pcr技术的叙述，不正确的是技术的叙述，不正确的是 ()。【巩固巩固2 2】 apcr技术是在实验室中以少量技术是在实验室

7、中以少量dna制备大量制备大量dna的技术的技术b反应中新合成的反应中新合成的dna又可以作为下一轮反应的模板又可以作为下一轮反应的模板cpcr技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增技术中以核糖核苷酸为原料，以指数方式扩增d应用应用pcr技术与探针杂交技术可以检测基因突变技术与探针杂交技术可以检测基因突变12 聚合酶链式反应聚合酶链式反应(pcr)是一种体外迅速扩增是一种体外迅速扩增dna片段片段的技术。的技术。pcr过程一般经历过程一般经历30多次下述循环：多次下述循环：94 条件条件下使模板下使模板dna变性、解链变性、解链56 条件下退火条件下退火(引物与引物与dna模板链结合模板链结

8、合)72 条件下引物链延伸条件下引物链延伸(形成新的脱氧核苷形成新的脱氧核苷酸链酸链)。下列有关。下列有关pcr过程的叙述，不正确的是过程的叙述，不正确的是 ()。【例例1】示例示例一一pcr技术及应用技术及应用13a变性过程中破坏的是变性过程中破坏的是dna分子内碱基对之间的氢键，分子内碱基对之间的氢键， 也可利用解旋酶实现也可利用解旋酶实现b退火过程中引物与退火过程中引物与dna模板链的结合是依靠碱基互补模板链的结合是依靠碱基互补 配对原则完成的配对原则完成的c延伸过程中需要延伸过程中需要dna聚合酶、聚合酶、atp、4种核糖核苷酸种核糖核苷酸dpcr与细胞内与细胞内dna复制相比，其所需

9、要酶的最适温度复制相比，其所需要酶的最适温度 较高较高思维导图：思维导图：14 下列有关下列有关pcr技术的叙述，不正确的是技术的叙述，不正确的是()。a又称聚合酶链式反应，是一种体外迅速扩增又称聚合酶链式反应，是一种体外迅速扩增dna片段片段 的技术的技术b在用在用pcr技术扩增技术扩增dna时，时，dna的复制过程与细胞内的复制过程与细胞内 dna的复制类似的复制类似cpcr反应只需在一定的缓冲溶液中提供反应只需在一定的缓冲溶液中提供dna模板以及模板以及 四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸dpcr一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、退一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、退 火、延伸火、

10、延伸【变式拓展变式拓展1】15 进行目的进行目的dna片段的体外扩增，下列选项不需片段的体外扩增，下列选项不需要的是要的是 ()。adna聚合酶聚合酶 b解旋酶解旋酶cmg2 d引物引物解析解析dna体外扩增是利用的体外扩增是利用的dna热变性原理，不需解热变性原理，不需解旋酶。旋酶。答案答案b【变式拓展变式拓展2】16下列关于下列关于dna复制叙述中，正确的是复制叙述中，正确的是 ()。adna聚合酶不能从头开始合成聚合酶不能从头开始合成dna，只能从，只能从5端延伸端延伸 dna链链bdna复制不需要引物复制不需要引物c引物与引物与dna母链通过碱基互补配对进行结合母链通过碱基互补配对进行

11、结合ddna的合成方向总是从子链的的合成方向总是从子链的3端向端向5端延伸端延伸解析解析本题主要考查了本题主要考查了dna聚合酶的作用特点。由于聚合酶的作用特点。由于dna聚聚合酶不能从头开始合成合酶不能从头开始合成dna，只能从引物的，只能从引物的3端延伸端延伸dna链。链。由于模板链首先复制的是由于模板链首先复制的是3端，即复制方向端，即复制方向35，而，而dna分分子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在子是反向平行的，子链是依据碱基互补配对原则，在dna聚聚合酶作用下合成的，其合成方向从子链合酶作用下合成的，其合成方向从子链53。答案答案c1.17pcr利用了利用了dna热变性的

12、原理，热变性的原理，pcr仪实际上是一种能仪实际上是一种能自动调节温度的仪器。下列对自动调节温度的仪器。下列对pcr过程中温度的控制的说过程中温度的控制的说法错误的是法错误的是 ()。a酶促反应需要高温，是为了保证模板是单链酶促反应需要高温，是为了保证模板是单链b延伸的温度必须高于退火的温度，而低于变性的温度延伸的温度必须高于退火的温度，而低于变性的温度c要用耐高温的要用耐高温的dna聚合酶聚合酶d需要耐高温的解旋酶需要耐高温的解旋酶解析解析pcr是体外是体外dna扩增技术，扩增技术，dna双链的解开不需双链的解开不需要解旋酶，靠高温使其变性。要解旋酶，靠高温使其变性。答案答案d218a向右的

13、过程为加热向右的过程为加热(80100 )变性的过程变性的过程b向左的过程是向左的过程是dna双链迅速制冷退火双链迅速制冷退火c变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同变性与在生物体内解旋过程的条件、实质都相同d图中图中dna片段共有片段共有4个游离的磷酸基、个游离的磷酸基、4个个3端端解析解析变性后的变性后的dna在缓慢降温后才会退火；变性与在生在缓慢降温后才会退火；变性与在生物体内解旋过程的条件不同，实质相同；任一物体内解旋过程的条件不同，实质相同；任一dna片段都片段都有有2个游离的磷酸基个游离的磷酸基(5端端)和和2个个3端。端。答案答案a下图为下图为dna变性和退火示意图，下列相关

14、说法正确的是变性和退火示意图，下列相关说法正确的是 ()。319pcr一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物次循环的产物也作为模板参与反应，由引物延伸而成的延伸而成的dna单链做模板时将单链做模板时将 ()。a仍与引物仍与引物结合进行结合进行dna子链的延伸子链的延伸b与引物与引物结合进行结合进行dna子链的延伸子链的延伸c同时与引物同时与引物和引物和引物结合进行子链延伸结合进行子链延伸d无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链解析解析此题考查同学们对此题考查同学

15、们对pcr反应中的变性、退火、延伸反应中的变性、退火、延伸的实质能否真正理解。当由引物的实质能否真正理解。当由引物延伸而成的延伸而成的dna单链做单链做模板时，此单链引物端为模板时，此单链引物端为5端，因此与它互补的子链应从端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即由引物另一端开始合成，即由引物结合延伸结合延伸dna子链。子链。答案答案b420在遗传病及刑侦破案中常需要对样品在遗传病及刑侦破案中常需要对样品dna进行分析，进行分析，pcr技术能快速扩增技术能快速扩增dna片段，在几个小时内复制出上百万份片段，在几个小时内复制出上百万份的的dna拷贝，有效地解决了因为样品中拷贝，有效地解决了因为样品中dna含量太低而难含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题。以对样品进行分析研究的问题。据图回答相关问题。521(1)在相应的横线上写出引物在相应的横线上写出引物，并在复性这一步骤中将引物，并在复性这一步骤中将引物置于合适的位置。置于合适的位置。(2)在相应的横线上写出循环一次后生成的在相应的横线上写出循环一次后生成的dna分子。分子。(3)若将作为原料的四种脱氧核苷酸用若将作为原料的四种脱氧核苷酸用32p标记，请分析