一株枯草芽孢杆菌分离鉴定汇编

1、产生芽胞菌霉素L,大侧柏酸，表面活性素三种物质的枯草芽泡杆菌BBK-1菌株的分离鉴定研究Niran Roongsawang? Jiraporn Thaniyavarn ? Suthep Thaniyavarn ? Takayuki Kameyama Mitsuru Haruki ? Tadayuki Imanaka ? Masaaki Morikawa ? Shigenori Kanaya摘要从泰国中部地区采集耐盐咸土，砂，海水和发酵食品等样品，分理得到二十三株耐盐 碱且产表面活性素的菌株，通过培养，发现一株产生物表面活性素活性较高的菌株，将其 命名为BBK-1 。 BBK-1菌株分离自发酵食

2、品中，通过生理生化试验和16SrRNA®因序列分析，将该菌株鉴定为枯草芽抱杆菌。实验发现，该菌株在添加16%勺氯化钠培养基上生长良好，在添加8%勺氯化钠培养基里 能同时产生三种表面活性脂肽，根据它们的分子量和 氨基酸成分，将这三种脂肽鉴定为芽抱菌霉素L,大侧柏酸，表面活性素。通过克隆和测序编码4-磷酸酰琉基乙胺基转移酶的生物合成基因，发现该氨基酸序列与枯草芽抱杆菌 RB14菌株产生的溶血磷脂酸基因十分相似。枯草芽抱杆菌RB14菌株同时也产生伊枯草菌素A和表面活性素。关键词芽抱菌霉素L 芽抱杆菌属生物表面活性素耐盐碱脂肽大侧柏酸莎梵婷引言生物表面活性素是由细菌和真菌产生的具有生物表面活

3、性的化合物，与化学表面活性 素相比，生物表面活性素更具优势，在工业生产上应用广阔(Fiechter 1992)。生物表面活性素通常为复杂脂类，比如糖脂、脂肽、磷脂和脂肪酸(Cooper and Zajic 1980)。芽抱杆菌属是一种常用的生产脂肽类物质如生物表面活性素(LPBS)和抗生素(LPAB)的工业生防菌(见表一)。LPB用口 LPAB®具有两性分子结构即同时含有亲水性和亲脂性部分，且大多具有环状结构B -羟基脂肪酸(B -羟基型)或B氨基脂肪酸(B-氨基型)。表面活性素是芽抱杆菌中最常见的 LPBS之一，其生物合成机理在基因水平和生化反 应中已深入研究(Quadri et

4、al. 1998; Peypoux et al. 1999)。 srfA 操纵子、comA以前称为srf B)和sfp是枯草芽抱杆菌产生物表面活性素不可或缺的三个遗传位点。srfA操纵子由四个开放阅读框组成，分别编码载体蛋白(PCP),消旋酶结构域和硫酯酶蛋白。这些蛋白形成一个非核糖体肽合成酶复合物(表面活性素合成酶)。srfA操纵子长度为28 KB(Cosmina et al.1993) 。 comA和 sfp 各自编码 srfA(Roggiani and Dubnau 1993) 的转 录激活酶和4'-磷酸酰琉基乙胺基转移酶(sfp磷酸酰琉基乙胺基转移酶/ PPTase, srfA

5、 的多元活化酶酶复合物)，(Nakano et al. 1992;Lambalot et al. 1996)。 sfp(PPTase)将表面活性素合成酶中的惰性的脂蛋白七PCFM转换成活泼的脂蛋白。已有报道证实大肠杆菌和酿酒酵母中的sfp经修饰后转录出不同的聚酮化合物 6- deoxyerythronolide B 和 6-甲基水杨酸合成酶(Kealey et al. 1998; Pfeifer et al. 2001)。 sfp具有较多的的酶切位点分别使非核糖体肽合成酶的七PCP域和聚酮合成酶的酰基载体蛋白(ACP)转录修饰成为可能。因此，PPTase在LPBS LPAB及聚酮化合物的生产中

6、是一个重要的、有价值 的酶。尽管他们在工业应用以及石油污染的治理中潜力巨大，但目前生物表面活性素只 能在温和条件下，从细菌和真菌中获得。有关在极端环境下产生生物表面活性素的报道较少 (Yakimov et al. 1995)。为了扩大生物表面活性素在工业上的应用，本课题组在泰国众多Jabk L StniictuTCiE 汨 LPBS/LPAB produced by HnWM strains.LPHE LPAB MW D5)PichIUjCIIStiuelureRidfcrencesSurfaiMLiift痴曲阳“1clyC, Pj hydroxy (attyKukinnma el nlMW

7、LW7-1015ATDC 21332,OKBI05uciid-L-Glu-L-Ltu Q LcuLAFab L-Afp-D-L iiGLn0叫fi ,“eWq a iMurikriwa et al.(LW)LiLheny&m AtJ. iu:henifomusCji-L'p fS-hydruxy fiillyI jkinriuv etBASSO'acid - l-Glii - LLeu 口 Leu L*a 1 L Asp4>Leu也 M*(L*W|Liehenysin Bfi卮融师心虱§G%/hydroxy fullyLin cl ;d. (1WJ)MM

8、 = L.()35JF-iacLd-L-Glu-L-Leu-D-LEUi-L-Vdl-L-Asip-D-LLm-L-Lcui1 .ichenysni CH firhmtftrfrrtir4'C |5 P'h)drcy fnthJenny el 4 (1 狗1)MW - iJB21-lJ035acid-Glii-Lc u-Le u- Vhl-Aip-Le u-lleSiurlacluiit HL册iJ.Cp-L p fS-hydruxy fdiltyUuruwiL/ dtidMW = 5)3 1 佃？aciid -L-GIx-L-Leu n-Leu-L-'al'L

9、-As-D-Leu-L-lle (1M)% 1/L-Val (40%)Oriffln (IW|)Plipziiiinfi trjirfwGrQ? P-hydruiy fMlyNishikiori a al.MM = L.4b2-l_5U4k!mI 13Mot”.|_方-0-allATht- X = Ala ar Vai(L9SfilHurin Afi匚1"匚好快iiminu fullyIsogai ei al. (1982)MM = L.UZMIJJTULicid -L-Ajbji-D-Lyt-D-Ajiii-L-Cilii-L-Prui-U-AMi-L-SErrBadlkimiyc

10、in LR*由盘“r4-C|rt mino fattyPc ptiux t LilMW - iJ020-L048NCIB 8S72uciid-L-Asfi-D F n D-Axii L Scr4Gln-D-“rLTh ru喇Mytios.ubtiJan时工uh曲EC4-C !? tS-affiLn-is fullyJJmliiian clLMW = L.fH2 打W4ATCCWir 271k i n -n 1 c r n 1 p l D、r 1 AwThe# LPBS LPAB arc uwadly a miMure of comjHiund ilh 仙仙”加1 杷曜I依 jnd lypes*

11、 UnneM上好of faliy 加id ehiiin The |J hvdruv or » ditniKi gruup ul ltly mMiJ furms utt e&lcr ur puplidt bund with Ibu carboxyl gruup ul d C-tefrtiintkl amino atid rtrsadut:. Phpa牌Htin K expected lo Inrm a l.aclnnc tracnirc between hydroxyl group of I -lyiosinc and carboxyl poup of C-lcrminal t

12、.-isoleuciinc高盐区采集了能够产生大量生物表面活性素的耐盐菌，并分离各种嗜盐菌。本实验分离鉴 定了一株耐盐芽抱杆菌BBK-1,发现并证实了 BBK-1菌株能产生芽抱菌霉素L,大侧柏酸， 和生物表面活性素。为了深入研究耐盐菌产生物表面活性素的机理通过借助分子生物学的 方法克隆编码PPTase的sfp同源基因。材料与方法从泰国中部采集各种样品，包括耐盐咸土，砂，海水和发酵食品，分离产生物表面活 性素的细菌。将这些样品稀释涂布在石油 2BGS琼脂平板上，30c下过夜培养。油1BGS 琼脂平板配方为(w/v) ： 1%细菌蛋白陈、酵母膏0.5%、1%葡萄糖、5%氯化钠、1.5%琼脂， Na

13、OH调节pH值为7.5、覆盖表面的原油为30ml。有油晕的菌落说明生产了生物表面活性 剂，(Morikawa et al. 1992)。挑取菌落，接种在LBGS液体培养基中，在30c下200 rpm搅 拌有氧培养24h。分离上精液，用于生物表面活性素的试验。生物表面活性剂生产量的测定培养液上精液中的表面张力通过环张力计测量(K6; Kruss, Germany)。临界胶束浓度(CMC)为表面张力开始增加时的浓度。需要达到 CMC稀释的定义是CMC-1 被认为和原始样品中的生物表面活性素的量成比例 (Sheppard and Mulligan 1987取表面张 力低于35mN/m,最高的CMC-

14、1值的培养液的细菌菌株进行下一步的实验。细菌菌株和质本实验已介绍的枯草芽抱杆菌BBK-1 ;源于马尔堡病毒168株并且不能产生表面活性素的 枯草芽抱杆菌 MI113 (arg-15, trpC2, hsrM, hsmM, sfp?)(Morikawa et al. 1992)；大肠杆 菌 DH5x F. ?80, lacZ?M15, recA1, endA1, gyrA96, thiT, hsdR17, ik-, mJ, SupE44, relA1 , deoR, ?(lacZYA-argF)U169, 2作为克隆程序的宿主；分别用来转化大肠杆菌 DH5a 和枯草芽抱杆菌的质粒 pUC19,

15、pCR2.1(Invitrogen, San Diego, CA),和 ptb523(Tcr ;Morikawa et al. 1992)2总DNA的提取枯草芽抱杆菌MI113和BBK-1的基因组DNA由肌氨酸法提取、CSCL四化乙锭平衡 密度梯度离心分离 (Morikawa et al. 1992)。总基因组的提取操作按照标准要求进行(Sambrook et al.1989)。采用阿纳格诺斯托普洛斯和斯皮宰曾描述的(1961)方法制备枯草芽 抱杆菌MI113感受态细胞，感受态细胞 用于转化。使用标准试剂盒从琼脂糖凝胶中回收 DNA片段(Bio101, La Jolla,CA)。采用质粒抽提试

16、剂盒(Qiagen, Hilden,Germany欢规模抽提 制备质粒 DNA。聚合酶链反应在第30个周期进入热循环，GeneAmp PCR系统 2400(Perkin-Elmer, Foster City, CA)。PCR 引物的寡聚核甘酸通过 sawady (Tokyo, Japa破生 活科技(Tokyo, Japan赎术合成，利用双脱氧末端终止法(Sanger et al. 1977)£用自动排序遗 传分析仪autosequencer ABI PRISM 310(Perkin-Elmer测定核甘酸序列。DNA测序结果采用 DNAsis 软件分析(Hitachi Software

17、, Tokyo, Japan)F口(NCBI,Bethesda, MD)。BBK-1菌株的鉴定根据伯杰系统细菌学手册(Sneath 1986进行BBK-1生理测试。为了确定16S rRNA基因 序列，BBK-1菌株的基因组 RNA利用基因组DNA提取试剂盒(BIO-RAD, Hercules, CA) 提取。标准PCR反应方法中合成区域编码16SRNA的DNA通用引物为： 5'-AAGAGTTTGATCATGGCTCAG-3' and reverse: 5'-AGGAGGTGATCCAACCGCA-3'。扩 增的基因片段用琼脂糖凝胶进行纯化然后克隆到pCR2.1

18、的TA克隆位点。依照上面的步骤及方法确定了 16S rRNA基因的核甘酸序列。LPBS和LPAB的分离和结构分析将BBK-1菌株接种在装有50ml液体优化培养基的250ml三角瓶中，30c , 200rpm 培养24h。体优化培养基成分(w/v): 0.5%蔗糖、0.2%硝酸俊，酵母膏0.5%,和3%氯化钠， PH值7.5。脂肽的回收：将含有表面活性素的 3L培养基离心，去除菌体(20000克为15分 钟4 C)0上精液加浓盐酸沉淀，pH为2.0,沉淀在4c下过夜。离心分离目标物，稀盐酸 洗涤三次(pH2.0)。甲醇提取三次色谱法纯化，必要时，溶剂在真空条件下使用旋转蒸发器lahlc 2* I

19、 he surlacc tensions and the surlacc activities of culture siipcrnjLints of haloiolcranl bacterial MrainSluingSurface lensiun (mN'ni)CMC1 (fold)BST1 2 BBW1-2BBW 2-2BBK-1BBT-2BBS1-10BCAV3 2BKS2 2BBS-lNii cell加1) 30.7 1.2 2X0 2K0 245 33 5 315 29。 5D 06716飞除去。反相高效液相色谱是在连接到一个HP1100(Hewlett Packard,

20、Palo Alto, CA)系统上的一个十八烷基硅胶柱中进行(Cosmosil 5c 18 AR 4.6 150 mm; Nacalai,Tokyo, Japan)色谱 分析的流动相在洗脱液 A(10%乙月青和0.1%氟乙酸)到洗脱液B(乙月青和0.05%氟乙酸)为0.5 毫升/分钟的流量中呈线性变化。通过它们在220nm的吸光率特性，我们可以监测到柱中的洗脱峰变化。最后的储分进行油位移测试(Morikawa et al. 1993),就可以知道表面活性素 的活性了。通过一个 API质谱LCQ(Thermo Finnigan, San Jose, CA测定分子的每个成分的 质量。最后在蛋白质研

21、究所及大阪大学通过日立L-8500型氨基酸分析仪测定氨基酸组成(Tokyo, Japan)BBK-1菌中编码PPTasM sfp基因同源克隆枯草芽抱杆菌BBK-1 16S rRNA基因和lpbk1基因的核甘酸序列已分别被上传在 DDBJ/ EMBL /GenBank数据库，检索号为 ab053351和ab062550,枯草芽抱杆菌 mi113 sfp旅音 酸序列检索号为ab061356结果产生物表面活性素的耐盐菌的分离。从泰国中采集的样品中分离得到二十三个阳性菌落。其中九株降低其培养上精液的表 面张力且低于35 mN/m。这些菌株被认为是产生生物表面活性素有效的。 一株，指定BBK-1 , 其

22、拥有最大的驱油晕并且具有最高的CMC-1值(28倍的LBGS)和最低的表面张力(28mN/m) 0 BBK-1菌株是从传统发酵食品中分离而出。BBK-1菌株的鉴定BBK-1在显微镜下观察呈杆状，能运动且形成抱子的革兰氏阳性细菌。当生长在多种 碳源包括葡萄糖、果糖、甘露醇、木糖和阿拉伯糖，应变检测为阳性，过氧化氢酶活性和 产酸阳性。BBK-1利用柠檬酸盐作为唯一碳源。BBK-1水解明胶、酪蛋白和淀粉，这表明 其拥有蛋白酶和淀粉酶。另一方面，呷咪试验、VP试验显示此菌株为阴性。该菌株在厌氧条件不生长。BBK-1能在含有0% T6%(w/v)的NaCl及25C和50c之间的环境下生长。 最佳生长温度

23、测得为45 Co我们测序了 16S rRNA基因的1450个碱基。比较序列分析表 明该菌株BBK-1属于芽抱杆菌属，对比枯草芽抱杆菌 atcc21331(ab18487其具有最高的相 似度(99%)。所有除VP测试外的生理测试结果与其他枯草芽抱杆菌一致，BBK-1在VP试验上为阴性，其他大多数枯草芽抱杆菌标明为阳性。氯化钠对生产生物表面活性素的影响生物表面活性素的生产由枯草芽抱杆菌 BBK-1在不同浓度的氯化钠的LBGS培养液中 测试。其产量在氯化钠浓度高于3%就受到抑制到5%氯化钠会加重而细胞生长不会受到影 响。10%的氯化钠中没有生物表面活性素产生。这些特征指明BBK-1菌株中度耐盐。生物

24、表面活性素的结构分析由高效液相色谱分析含有表面活性素的甲醛溶液，据透露，枯草芽抱杆菌BBK-1同时生产三种生物表面活性素。这些根据洗脱时间的顺序初步命名为BS-A(18 - 22 , 5分钟)，HPLC an ilyMR at m甘HkmM tKEriiiUl& canDuiniiiijz hib看uHstEunl iitliVily. The mEiluculdr U'eight til ezch cumptMictU is ,huwii tf6trt!E* Ehtr peukBS-B（23 - 24分钟），和BS-C（29-32分钟）（图1）。BS-A显示系列的质谱的离子M

25、 + H+ / z = 993, 1007, 1021, 1035, 1049,和 1063 年的 BS-B 被发现在M + H+ / z = 1463, 1477 年 和 1505 年，和那些 BS-CM + H+ / z = 994, 1008, 1022, 1036, 1036。一套 14 个区间的 质量峰往往是在脂肪酰基链（Morikawa et al. 2000）里由不同数量的亚甲基（-CH2-）脂肽观察 推测。对每个化合物的氨基酸组成进行了分析：BS-A含有，酪氨酸、谷氨酸、门冬氨酸和 丝氨酸比分别为1:1:122。BS-B组成中，鸟氨酸，苏氨酸，丙氨酸，脯氨酸、异亮氨酸、 酪氨酸

26、和谷氨酸比分别为1:1:1:1:123,和BS-C包含谷氨酸、大冬氨酸、缴氨酸、亮氨酸， 比例为1:1:1:4。谷氨酰胺、天冬酰胺不能从谷氨酸和大冬氨酸分化，特别是在这些条件下，由于水解反应引起了这些氨基酸的脱氨基作用。上述结果有力的表明，BS-A , BS-B和BS-C分别是脂肽芽抱菌霉素L,大侧柏酸，和表面活性素，见（表1）。它们脂肪酸部分的碳数分 别被推断为12C - C17、16C - C19和C12 - C16。在改性培养液中 BS-A、BS-B BS-C产出 比例大约是5:1:15（图1）。在30c条件下培养24h脂肽的总产量约为480 mg /L。对枯草芽胞杆菌BBK-1产生的L

27、PBSffi LPA由勺活性比较枯草芽抱杆菌BBK-1产生的三种脂肽被反相高效液相色谱纯化并用驱油法对表面活性 素进行活性测定。芽抱菌霉素 L,大侧柏酸，和表面活性素这三种脂肽表现出显著的表面 活性素的活动。每一种物质的驱油活性207.5平方厘米/毫克（芽抱菌霉素L）, 659.5平方厘米/毫克（大侧柏酸），和1840平方厘米/毫克（表面活性剂）。碳源对产生生物表面活性素的影响在对产生生物表面活性素的培养条件的优化中，发现 BBK-1在含盐量3%的LBGS中 产生生物表面活性剂的量最大，（CMC-1 = 40-fold）。接下来，葡萄糖被其他几个碳源取代用 来研究碳源对生产的影响。碳源的测试，

28、发现葡萄糖是用于生产的所有这些脂肽中的最好 的碳源，（图2A）。同时，蔗糖，尤其是石蜡油使得大侧柏酸和表面活性素生产下降，但芽 抱菌霉素L几乎不受影响，甘油显著减少了所有脂肽的产生量 （图2B, C, D）osfp同系物的克隆枯草芽抱杆菌OKB105的sfp基因已被证明是用来编码4'-磷酸泛酰琉基乙胺基转移酶 (PPTase)它是脂肽合成酶复合物的必不可少的修饰酶。在枯草芽抱杆菌RB14(lpa-14)基因的同系物sfp据报道可用来生产表面活性素(LPBS)H和伊枯草菌素A(LPAB)(Huang et al. 1993)。止匕外，sfp(PPTase显示可用在聚酮合酶中酰基载体蛋白的

29、合成 (Pfeifer et al. 2001年)。 上面的信息促使我们分离和分析 BBK-1 sfp的同源序列。核甘酸序列分析的sfp做自枯草 芽抱杆菌MI113但不同于sfp基因，因为它替换五个碱基和插入了一个碱基。插入结果是 发生了移码和形成了 165 -氨基酸惰性蛋白sfp?,这些结果与中野(1992)报告的一致。在印 迹分析中 MI113菌的sfp?乍为探针操作于 EcoRI-digested BBK-1基因组DNA 提取4 kb EcoRI片段。我们对这4 kb片段测序。正如预期的那样，它包含一个假定的基因，我们指 定为lpbk1,与sfp高度同源。在Southern杂交的单一条带

30、的存在表明，BBK-1基因组只 包含一个sfp相似基因，尽管它有能力生产三种脂肽。该 4 kb EcoRI片段然后克隆到 pTB523并转移到枯草芽抱杆菌 MI113(非表面活性素生产者)来补充现有的突变sfp?。枯草 芽抱杆菌的转化株MI113 surfactin产生的重组质粒令其能产生表面活性素。止匕外，在 pbk1 基因的二级翻译中引入移码突变使其互补能力受损。这清楚地表明，lpbk1及其转录的PPTase细胞内是全功能性的。lpbk1与其他同源基因的比较lpbk1基因编码PPTase的224个氨基酸。这个基因先于其他同源序列与枯草芽抱杆菌 基因核糖体结合位点ACGGAG GATC结合，

31、然后五碱基启动上游 ATG起始密码子。两组 基因序列比对(表3)。BBK-1 PPTase与Lpa-14 RB14(Huang等，1993年)对比具有98%枯草 芽抱杆菌的氨基酸序列的相似度，然而其与Lpa-8枯草芽抱杆菌YB8(Tsuge et al. 1996年)和枯草芽抱杆菌的sfp OKB105(Nakano et al. 1992年)对比只有66%的的相似度。Lpa-14的 氨基酸残基Ala22、Gly65 Gly69和Glu216分别由BBK-1 PPTase(5 3)的苏氨酸,丙氨酸， 丝氨酸，丙氨酸取代，分别在。sfp(PPTase的晶体结构已经确定同时催化机理已经提出了 测试

32、(Lambalot et al.1996; Reuter et al.1999) sfp与SrfA七PCP域相似的效率催化转移辅酶 A的4'-磷酸泛酰琉基乙胺基转移酶中一部分为丝氨酸。BBK-1 PPTase呆存所需的所有功能氨基酸残基在 sfp His90, Gly105, Asp107, Glu1基,Trp147, Lys150, Glu151, Lys155。 这个实验结果支持lpbk1补充在枯草芽抱杆菌MI113的sfp0突变。讨论据报道，枯草芽抱杆菌RB14,YB8和ATCC6633分别产生表面活性素和伊枯草菌素 A, 表面活性素和大侧柏酸B1,表面活性素和抗霉枯草菌素，(H

33、uang et al.1993;Tsuge etal.1996;Duitman et al.1999)。耐盐地衣芽抱杆菌菌株bas50产生一种表面活性素衍生物(Yakimov et al.1995)地衣素。本实验分离得到的耐盐枯草芽抱杆菌BBK-1能同时生产三种表面活性的化合物：芽抱菌霉素L,大侧柏酸，表面活性素。从BBK-1菌株中纯化得到芽抱菌霉素L,大侧柏酸，表面活性素其中表面活性素是最 优秀的生物表面活性素。酰胺化和甲基化程度越高，说明疏水化合物越多，表面活性素活 性越高。(Morikawa et al.2000)。Asp和Glu负电荷的损失导致表面活性素活性增加1,2倍。也有报道显示地

34、衣素 A活性高于表面活性素是因为表面活性素的谷氨酸被地衣素中的谷 氨酸盐替代(Yakimov et al. 1999)。Hopp和Woods (1983)测试了谷氨酸盐和谷氨酸的亲水 性指数分别为3.0和0.2。表面活性素的疏水性由以下事实证明。首先是在反相高效液相色谱中洗脱时间晚(29-32min,表1)其次其是由氨基酸组成的。表面活性素的肽段由五个疏水 (4个亮氨酸和缴氨酸)氨基酸和两个亲水(谷氨酸和大冬氨酸)氨基酸组成。大侧柏酸包含五 个疏水性(丙氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、两个酪氨酸)氨基酸和五个亲水(谷氨酰胺、2个谷丸 HdmMcigy between10203040BBK-1 PPTi

35、w of ft mMilirBBK-1MKIYGVYMDRPLSAOEEDRMKTAVSAXKUXCRHTYBKEDBBK-1. with Lpa-14 of ilunn ALpa-14KRlTGVnWRPLSAQ»DRMMAAVSASKREXCMFltaKED.iiul Mirfjctin ci j pmduizing itL |j FV n, d 1a *. o *Lpa-flMKIYGITMDRPLSQEENERFHSFISPEKREKCARFYBKEDu,由x RBIM. Lg出 M phpUhn. Bl nncl surfiLcilin. c0SfpKKIYCITMDRPL

36、SQEENERFHTFISPEKEIE*KCRRFYHKED *pritduAzing ft. wbiibh YIW ：miJ Sfp mt &urfdctm pruducimg B.50«070ao，姓加廿"OKU 1 (.15.BBK-1AHHTLIGDMLIRTAJUULKYaLDPAAISFSVQETGKPTIPAindLcstl CHlal0tiEiilly imjKirl4nlLpa«14WKTL8DMLIRTAAAKATQLDPAOISFGVQElGKPlftFAand highly ctinservtrd ammo ucidLpa-flAH

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38、016。BBK-1RFFSPTETSPDYFYBLWSMKESF1KQ鼻GKGLp«-14RFFSPTEYSDLQAKHPDQQTD¥FYHLWSMKESFIKQAGKGLp«-8RFFSKTE¥S1>LLAXDK0WT触LWSMXESPIXQEGKGSfpRFFSKTEXfiDLXAKDKDEQTDYFYBLWSMKESFIKQEGKG* *17018。190200BBK-1LSLPLDSFSVELLKDDGEVSIELPDGHEPCF1RTYDADEEYLpa-14LSLfLBSFSVELLKDDGttVSlELPDGHEPCFXRT¥DAPEETLpa-*LSLPLDSFSVRLHQDGQVSIELFDSESFCYIKTTEVDPGTSfpLSLPLDSFSVRLHQDQQVSIn.PDSHSmirrxEvopqT210220230240KLAVCAAHPDFC&GlAMXTrEtLLLp占4KLAVCAMPDFC