实验51毛细管电泳非接触式电导法应用

1、 引言引言 毛细管电泳基本理论毛细管电泳基本理论 毛细管电泳中的电渗流毛细管电泳中的电渗流 参数与关系式参数与关系式 进样方式进样方式 检测器及数据工作站检测器及数据工作站 毛细管电泳仪结构毛细管电泳仪结构 应用示例应用示例 实验目的实验目的 实验内容实验内容 预习要求预习要求内容内容 在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳电泳。由于由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。不同离子所带电荷及

2、性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。 1937年，年，蒂塞利乌斯蒂塞利乌斯 Tiselius，瑞典，瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和的蛋白质混合液分离出白蛋白和、球蛋白；球蛋白； 1948年，年，获诺贝尔化学奖。获诺贝尔化学奖。 利用利用电泳电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法电泳法或或电泳技术电泳技术。 按形状分类：U型管电泳、柱状电泳、板电泳； 按

3、载体分类：滤纸电泳、琼脂电泳、聚丙烯酰胺电泳、自由电泳； 传统电泳分析：操作烦琐，分离效率低，定量困难，无法与其他分析相比。 1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径石英毛细管进行电泳分析，柱效高达40万/m，促进电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术 高效毛细管电泳高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis ，HPCE）。 毛细管的采用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，使电场电压可以很高。 电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱径变小，柱长增加， 高效毛细管电泳的

4、柱效远高于高效液相色谱，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。高效毛细管电泳分析的特点高效毛细管电泳分析的特点1.仪器简单、易自动化仪器简单、易自动化 电源、毛细管、检测器、溶液瓶2.分析速度快、分离效率高分析速度快、分离效率高 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105107/m理论塔板数；3.操作方便、消耗少操作方便、消耗少 进样量极少，水介质中进行；4.应用范围极广应用范围极广 有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等； 分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等； 高效毛细管电泳高效毛细管电泳(HPCE)基本理论

5、基本理论 basic principles of HPCE 电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移电泳是指带电离子在电场中的定向移动，不同离子具有不同的迁移速度，速度，迁移速度与哪些因素有关？迁移速度与哪些因素有关？ 当带电离子以速度当带电离子以速度 在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电在电场中移动时，受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。场推动力和平动摩擦阻力的作用。电场力：电场力：FE = qE 阻阻 力：力：F = f故：故： qE = fq离子所带的有效电荷；E 电场强度；离子在电场中的迁移速度；f 平动摩擦系数 ( 对于球形离子： f =6

6、； 离子的表观液态动力学半径； 介质的粘度； )所以，迁移速度：所以，迁移速度： 或 物质离子在电场中物质离子在电场中差速迁移差速迁移是电泳分离的基础。是电泳分离的基础。淌度淌度 ：单位电场强度下的平均电泳速度。：单位电场强度下的平均电泳速度。 毛细管电泳中的电渗流毛细管电泳中的电渗流 当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层。固界面形成双电层。 当充满液体的毛细管两端施加电压当充满液体的毛细管两端施加电压时，就会发生管中液体相对

7、于毛细管管时，就会发生管中液体相对于毛细管管壁表面作整体移动的现象，壁表面作整体移动的现象，称之为称之为电渗电渗流流（electro osmotic flow ，简称，简称EOF）。）。 石英毛细管柱，内充液石英毛细管柱，内充液pH3时，表面电离成时，表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷，管内壁带负电荷，与溶液离子间与溶液离子间形成双电层。形成双电层。 在高压电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由在高压电场的作用下，带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动，由于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移动，于这些阳离子实际上是溶剂化的，故将引起柱中的溶液整体向负极移

8、动，速度速度电渗流电渗流。 电渗流的大小用电渗流速度电渗流的大小用电渗流速度电渗流电渗流表示，取决于电渗淌度表示，取决于电渗淌度和电场强度和电场强度E。即即 电渗流电渗流 = E电渗淌度取决于电泳介质及双电层的电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势，即电势，即 = 00真空介电常数；介电常数；毛细管壁的Zeta电势。 电渗流电渗流 = 0 E实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算实际电泳分析，可在实验测定相应参数后，按下式计算 电渗流电渗流 = Lef/teoLef 毛细管有效长度； teo电渗流标记物（中性物质）的迁移时间。孔隙率与孔径：孔隙率与孔径： 电渗流的方向取决于毛细

9、管内表面电荷的性质：电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质： 内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极；内表面带负电荷，溶液带正电荷，电渗流流向阴极； 内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极；内表面带正电荷，溶液带负电荷，电渗流流向阳极； 石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；石英毛细管；带负电荷，电渗流流向阴极；改变电渗流方向的方法：改变电渗流方向的方法： （1）毛细管改性）毛细管改性 表面键合阳离子基团； （2）加电渗流反转剂）加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂，将使石英毛细管壁带正电荷，溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。 电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的电

10、渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍；倍； 各种带电离子在毛细管柱中的迁移速度为：各种带电离子在毛细管柱中的迁移速度为： + =电渗流电渗流 + +ef 阳离子运动方向与电渗流一致；阳离子运动方向与电渗流一致； - =电渗流电渗流 - -ef 阴离子运动方向与电渗流相反；阴离子运动方向与电渗流相反； 0 =电渗流电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致；中性粒子运动方向与电渗流一致；（1）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；）可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离；（2）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变）改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性，如同改变LC中

11、中的流速；的流速；（3）电渗流的微小变化影响结果的重现性；）电渗流的微小变化影响结果的重现性； 在在HPCE中，控制电渗流非常重要中，控制电渗流非常重要。（1）电场强度的影响）电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比，当毛细管长度一定时，电渗流速度正比于工作电压。（2）毛细管材料的影响）毛细管材料的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同，产生的电渗流大小不同；（3）电泳运行液的影响）电泳运行液的影响溶液溶液pH的影响的影响 对于石英毛细管，溶液pH增高时，表面电离多，电荷密度增加，管壁zeta电势增大，电渗流增大； pH电泳电泳时时,阴离子在负极最后流出阴离子在负极最后流出,在这种情况在这种

12、情况下下,不但可以按类分离不但可以按类分离,同种类离子由于同种类离子由于差速差速迁移迁移被相互分离。被相互分离。 最基本、应用广的分离模式；最基本、应用广的分离模式；2. 毛细管凝胶电泳（毛细管凝胶电泳（CGE) 将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。 其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。 蛋白质、蛋白质、DNA等的电荷等的电荷/质量比与分子大小无关，质量比与分子大小无关，CZE模式很难分离

13、，模式很难分离，采用采用CGE能获得良好分离，能获得良好分离，DAN排序的重要手段。排序的重要手段。 特点特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。烯酰胺。柱便宜、易制备。3. 胶束电动毛细管色谱（胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC） 缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。疏水内核、外部带负电的胶束。在电场力的作用

14、下，胶束在柱中移动。在电场力的作用下，胶束在柱中移动。 中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；结合的较牢，流出时间长； 可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围； 1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术；根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术； 2. 毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基多羧酸混合物），当施加直流电压

15、（合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度；梯度； 3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零；4. 聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离；的位置时，呈电中性，

16、停止移动，形成窄溶质带而相互分离；5. 阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液；溶液；6. 加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；加压将毛细管内分离后的溶液推出经过检测器检测；7. 电渗流在电渗流在CIEF中不利，应消除或减小。中不利，应消除或减小。4. 毛细管等电聚焦（毛细管等电聚焦（CIEF） 5. 毛细管等速电泳（毛细管等速电泳（CITP） 1. 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子(充满毛细管充满毛细管)和尾和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速度移动。随离子，试样离子的淌度全部位

17、于两者之间，并以同一速度移动。 2. 负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带试样都按前导离子的速度等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。而分离。阴极进样，阳极检测。 3. 不同离子的淌度不同，所形成区带的电场强度不同(=E)，淌度大的离子区带电场强度小； 沿出口到进口，将不同区带依次排序1、2、3、4 电场强度依次增大。假设“2”号中离子扩散到“3”号，该区电场强度大，离子被加速，返回到“2”区；当“2”号中离子跑到“1”号区，离

18、子被减速使之归队； 4. 特点：界面明显，富集、浓缩作用；6. 毛细管电色谱（毛细管电色谱（CEC） 在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程；试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程；HPCE的检测器的检测器高效毛细管电泳仪高效毛细管电泳仪high performance capillary electrophoresis apparatusHPCE的仪器系统的仪器系统1. 仪器主要部件仪器主要部件 高压电源：高压电源：030kV； 毛细管分离柱毛细管分离柱

19、 紫外、激光诱导荧光、电导、安培检测器等。紫外、激光诱导荧光、电导、安培检测器等。 毛细管数据工作站毛细管数据工作站（1）030 kV 稳定、连续可调的直流电源；稳定、连续可调的直流电源；（2）具有恒压、恒流、恒功率输出；）具有恒压、恒流、恒功率输出；（3）电场强度程序控制系统；）电场强度程序控制系统；（4）电压稳定性：）电压稳定性：0.1%；（5）电源极性易转换；）电源极性易转换； （1）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差；）材料：石英：各项性能好；玻璃：光学、机械性能差； （2）规格：内径）规格：内径 2075 m，外径，外径350400 m；长度；长度1m 毛细管是毛细管是C

20、E分离的心脏。理分离的心脏。理想的毛细管必须是电绝缘、紫外想的毛细管必须是电绝缘、紫外/可见光透明且富有弹性的，目前可见光透明且富有弹性的，目前可以使用的有玻璃、熔融石英或可以使用的有玻璃、熔融石英或聚四氟乙烯塑料等。毛细管内径聚四氟乙烯塑料等。毛细管内径一般为一般为10100 m，其截面结构，其截面结构图标意图如图图标意图如图17.23所示。所示。 紫外检测器的核心部件紫外检测器的核心部件电导检测器电导检测器 电导检测（电导检测（Conductivity Detection, CD）是基于分离分析组分的）是基于分离分析组分的电导和电泳运行液电导之间的差异而进行测量的一种方法。在电导和电泳运行

21、液电导之间的差异而进行测量的一种方法。在CE中，中，几乎所有的分析组分（包括中性组分）都可以被检测，所以电导检测几乎所有的分析组分（包括中性组分）都可以被检测，所以电导检测器是一种通用型的检测器，检出限一般可以达到器是一种通用型的检测器，检出限一般可以达到10-7mol/L。它具有灵。它具有灵敏、死体积小、操作简便，应用范围广，造价低和易于微型化（集成敏、死体积小、操作简便，应用范围广，造价低和易于微型化（集成化）的特点，在常规化）的特点，在常规CE和芯片和芯片CE中有着极大的应用价值。与其他检中有着极大的应用价值。与其他检测器相比，具有明显的特点和优势。测器相比，具有明显的特点和优势。 电导

22、检测，按电导电极与溶液接触与否，可分为接触式（电导检测，按电导电极与溶液接触与否，可分为接触式（contact）和非接触式和非接触式(contactless)两种。两种。 柱端接触式电导柱端接触式电导毛毛细细管管高高压压地地电电导导电电极极储储液液瓶瓶电导检测器的核心部件电导检测器的核心部件C4D非接触式电导非接触式电导1：毛细管；：毛细管；2：准直管；：准直管；3：储液池：储液池4,6：电导电极；：电导电极；5：高压地：高压地电导检测器的核心部件电导检测器的核心部件毛细管电泳数据工作站毛细管电泳数据工作站教学型CES2003毛细管电泳仪实物图高压电源高压电源进样端进样端检测池检测池电导检测器

23、电导检测器数据工作站数据工作站HPCE应用示例应用示例阳离子分析阳离子分析 迁移方向和电渗流方向一致；迁移方向和电渗流方向一致； 4.5min内分离了内分离了24种金属离子；种金属离子； 阳极进样，阴极检测；阳极进样，阴极检测； 具有很高的灵敏度；具有很高的灵敏度； 阴离子电泳方向和电渗流方向相反、阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近，分析时间长、效率低；速度接近，分析时间长、效率低； 质量小、电荷密度大的离子如：质量小、电荷密度大的离子如：SO4-2、Cl-、F-等，电泳速率大于电渗流，等，电泳速率大于电渗流，阳极端流出，在阴极端无法检测；阳极端流出，在阴极端无法检测； 加入电渗流改性剂

24、，十六烷基三甲加入电渗流改性剂，十六烷基三甲基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向基溴化胺等，使电泳方向和电渗流方向一致，可在一致，可在3.1min内分离内分离36种阴离子；种阴离子；阴极进样，阳极检测；阴极进样，阳极检测； 离子价态及存在形态分析；离子价态及存在形态分析； 检测体液或细胞中某些代谢产物的分析；检测体液或细胞中某些代谢产物的分析； 尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段；的辅助手段； 采用毛细管区带电泳方式，在采用毛细管区带电泳方式，在11min内分内分离离17种药物；种药物；采用采用MEKC模式，鉴定违禁药物；效果优于模式，鉴定违禁药物

25、；效果优于HPLC法法 合成获得单一手性化合物相当困难；合成获得单一手性化合物相当困难；528种手性合成药物，种手性合成药物，61中以单一对映中以单一对映体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；体形式销售，其他为外消旋体；检测分析也相当困难；研究热点；R-反应停是安眠药，反应停是安眠药，S-式致胎儿畸形；式致胎儿畸形； HPCE分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂；分离分析手性化合物的方法：加入手性选择剂； 形成配合物的稳定常数有差异，结合形成配合物的稳定常数有差异，结合HPCE的高效率；的高效率； 常用手性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸常用手

26、性选择剂：环糊精及其衍生物；手性冠醚；手性表面活性剂（氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂）analysis of amino acids采用采用MEKC模式，在模式，在25分钟内分离了分钟内分离了23种丹酰化氨基酸；种丹酰化氨基酸；HPCE可取代传统的氨基酸分析仪；可取代传统的氨基酸分析仪；问题：吸附和检测；问题：吸附和检测；重要分析手段；右图：酶解的双螺旋DNA限制性片段的分离； 学习高效毛细管电泳仪（HPCE）的操作使用。 熟悉高效毛细管电泳法分析的基本原理和实验方法。 掌握饮用纯净水中 Cl-、NO3-、SO42-的毛细管电泳分离/电导检测的测定原理和技术。实验目的实验目的实验内容实验内容 本实验采用四乙烯五胺作为毛细