淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定

1、南昌大学实验报告淀粉酶产生菌的筛选及酶活力测定一、实验目的：1、学习从土壤中分离微生物的方法；2、学习淀粉酶产生菌的筛选方法3、了解分光光度计法测定酶活力的原理及方法。二、实验原理：土壤中含有大量的微生物，将土壤稀释液涂在不同类型 的培养基上，在适宜的环境中培养几天，细菌或者是其他的 微生物便能在平板上生长繁殖，形成菌落。将初次筛选得到 的微生物接到淀粉培养基上培养，因为只有能够产生淀粉酶 的细菌才能够利用培养集中的淀粉成分来完成自身的生命 活动，才能够生存。故在淀粉培养基上长出的菌便是淀粉产 生菌。在培养基上滴碘液，淀粉被分解掉的部分不显现蓝色， 出现透明圈，可以通过透明圈的大小来初步判断菌

2、种产淀粉 的能力。淀粉酶是指一类能催化分解淀粉分子中糖苷键的酶的总称，主要包括a淀粉酶和B -淀粉酶等，a -淀粉酶可从 淀粉分子内部切断淀粉的a -1,4糖苷键，形成麦芽糖、含有 6个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖，是淀粉的粘度下降，因此又称为液化型淀粉酶。淀粉遇碘呈蓝色。这种淀粉- 碘复合物在 660nm 处有较大的吸收峰，可用分光光度计测 定。随着酶的不断分作用，淀粉长链被切断，生成小分子的 糊精，使其对碘的蓝色反应逐渐消失，因此可以根据一定时 间内蓝色消失的程度为指标来测定a-淀粉酶的活力。三、实验器材及试剂：1、培养基：（1）分离培养基：牛肉膏蛋白胨固体培养基（牛肉膏3g、蛋白胨1

3、0g、NaCI5g、溶于1000mL蒸馏水中，再加入15g琼脂粉，pH调至，121C灭菌15min，待冷却至 50C左 右时，于超净工作台倒平板）（2） 筛选培养基：淀粉培养基（可溶性淀粉20g, 硝酸 钾 1g, 磷酸氢二钾 , 氯化钠 , 硫酸镁 , 硫酸亚铁 , 琼脂 20g, 水 1000毫升，调整pH值到。）（3）摇瓶培养：淀粉培养液。2、试剂：碘液、 2%可溶性淀粉、磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液、标 准糊精溶液、 L 乙酸、 %生理盐水。3、器材： 培养皿、锥形瓶、高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴 锅、分光光度计。四、实验步骤：1、淀粉产生菌的筛选：（1）采集土样，并用无菌水稀释成

4、菌悬液；（ 2）配置牛肉膏蛋白胨固体培养基及淀粉培养基，倒 平板备用；（ 3）将制好的菌悬液与超净工作台上涂到牛肉膏蛋白 胨平板上，于 37 摄氏度培养箱中培养一天；（ 4）挑取整个菌落，将其移入淀粉培养基中，继续放在 37 摄氏度培养箱中培养两天；（5）将碘液滴在平板上，观察透明圈的大小。2、酶活力测定：（ 1）选产生透明圈最大的菌株进行摇瓶培养，将菌溶 于 5ml 无菌生理盐水中，吸取此培养液加入淀粉培养液中， 30 摄氏度摇瓶培养 72h。（2）酶液稀释：取发酵液进行 4000r/min 离心 5min ，取上清液， 用缓冲 液适当稀释。（3）标准曲线制作： 准备七支试管，按照下表配置混

5、合液。使用分光光度计策规定各管溶液在 660nm下的0D值。然后以淀粉浓度为横 坐标，吸光度为纵坐标，做标准曲线。（4）酶活力测定取稀释的粗酶液也按照下表中七号管 的要求配置混合液，测得吸光度后，在标准曲线上查出相应的淀粉浓度，求出被酶消耗的淀粉量管号i234567淀粉稀释液/ml2( 0%2( %2( %2( %2( %2( %2( %缓冲液/ml111111140摄氏度水浴保温 5min管号1234567蒸馏水/ml1111110粗酶液/ml000000140摄氏度水浴保温 30min，然后放入沸水浴 5min,每管加入稀碘液1ml(5) 酶活力测定：酶活力以每毫升粗酶液在 40摄氏度，的条件下每小时 所分解的淀粉毫克数来衡量。五、实验结果：1淀粉产生菌的筛选：淀粉产生菌透明圈的检验图2、酶活力测定：(1)实验预测数据：管号1234567分解淀粉数/mg0( 2)计算：样品的 OD660= 查标准曲线可得：淀粉含量 =初始淀粉含量=2g/100ml x 2ml=40mg 被消耗的淀粉含量 =40mg =酶活力=(1ml x =(ml h)六、实验结果分析： 平板菌落水解圈直径大小受许多因素的影响 , 例如菌