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文档简介

1、western blot 实验技术 张 蓓western blot基本原理基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 一、实验原理 western blot法又称免疫印迹法（ibt），分三个阶段进行。 第一阶段：sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sds-page）。 第二阶段：电转移。 第三阶段：固相酶免疫测定。三、三、固相酶免疫测定检测固相酶免疫测定检测ena自自身抗体身抗体（一）原理（一）原理 （二）材料 1、洗涤液：含0.05吐温-20的ph7.4的pbs 2、酶标抗人igg 3、阴性对照血清、阳性对照血清 4、底物溶液 5、终止液 6

2、、恒温摇床、微量加样器、反应槽、塑料袋、 滴管、吸管等。 （三 ）方法 1次日取出已封闭的nc膜，用洗涤液漂洗5次，每次1min。 2. 将剪下条带放入反应槽中，加入1ml洗涤液，再已加入20l血清混匀，37恒温摇动40min。 3取出洗涤液漂洗5次，每次1min。 4加入1ml酶标羊抗人igg，37恒温摇动30min。 5取出洗涤液漂洗5次，每次1min。 6加入底物液1ml，显色10min。 7加入终止液终止反应。 结果判断结果判断 用肉眼观察。出现染色条带为阳性，不出现染色用肉眼观察。出现染色条带为阳性，不出现染色条带为阴性，不同的疾病可以出现不同的条带。跟据条带为阴性，不同的疾病可以出现不同的条带。跟据条带位置条带位置 判断结果。判断结果。判断标准：判断标准：1 1抗抗smsm抗体：同时出现抗体：同时出现29kd29kd、28kd28kd、13.5kd13.5kd条条带。带。2 2抗抗ssassa抗体：抗体：60kd60kd、52kd52kd任意出现一条带。任意出现一条带。3 3抗抗ssbssb抗体：抗体：47kd47kd、45kd45kd应用时出现条带。应用时出现条带。4 4抗抗jo-1jo-1抗体：抗体：55kd55kd出现条带。出现条带。5 5抗抗scl-7

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