TUNEL检测方法

1、TUNEL检测方法 DeadEnd?ColorimetricTUNEL System试剂盒法检测原理 ：细胞凋亡时，其DNA会产生 3 -OH末端，而正常细胞则几乎没有。使用末端脱氧核苷转移酶(TdT 酶 ) 将生物素标记的核苷酸连接到DNA的 3 -OH末端。再将辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素(StreptavidinHRP)结合在此核苷酸上。StreptavidinHRP可与过氧化物酶的底物过氧化氢和稳定的显色剂氨基联苯胺 (DAB)产生深棕色反应。即可通过光学显微镜观察到凋亡细胞。材料试剂盒（ G7130）内容：名称量说明平衡缓冲液9.6ml生物素标记的核苷酸混合40 l2×

2、20 l物TdT 酶40 l2× 20 lStreptavidinHRP40 l0.5mg/mlDAB 20X Chromogen200 lDAB Substrate 20X Buffer200 lHydrogen Peroxide 20X200 lSSC, 20X70mlProteinase K10mgPlastic Coverslips40(2× 20)储存条件 :平衡缓冲液 ,TdT 酶 ,生物素标记的核苷酸混合物，蛋白酶K： 20° CStreptavidinHRP,DAB 20XChromogen,20XDAB 底物缓冲液， 20X 过氧化氢：4

3、6; C20XSSC，塑料盖玻片：室温保存需自备：PBS 缓冲液0.3%过氧化氢溶液（用以抑制内源性过氧化氢酶）固定液（例如： 10%缓冲的福尔马林，4%多聚甲醛， 4%无甲醇甲醛）封固剂用于组织的检测方法由试剂盒内容制备：20g/ml蛋白酶 K 工作液：10mg蛋白酶 K 1ml 蛋白酶 K 缓冲液 r 10mg/ml 蛋白酶 K 储备液 20 g/ml蛋白酶K 工作液TdT 酶反应液（使用时制备） ：缓冲液成分每标准反应次数（实验成分的体100ul反 应反应+选择性阳积的成分体积性对照）平衡缓冲液98ul×=生物素化的核苷混1ul×=合物rTdT 酶1ul×=

4、2X SSC：用去离子水 1：10 稀释 20XSSCStreptavidinHRP工作液 ：以 PBS500：1 稀释 StreptavidinHRP.DAB混合液（使用时制备，避光，<30mins ）：950ul 去离子水 50ul20XDAB底物缓冲液 50ulDAB 20X色原体50ul20X 过氧化氢步骤：1. 0.85%氯化钠溶液浸洗 5mins（室温）2. PBS浸洗 5mins（室温）3. 4%多聚甲醛溶液或含 10%福尔马林的 PBS溶液中固定 15 mins （室温）4. PBS浸洗二次，每次 5 mins（室温）5. 除去多余液体， 滴加 100L 20 g/ml

5、蛋白酶 K 工作液， 覆盖组织。 置于平面，孵育 10-30mins （室温）。6. 染色缸内 PBS浸洗 5mins。（室温）7. 4%多聚甲醛溶液或含 10%福尔马林的 PBS溶液固定 5 mins。（室温）8. PBS浸洗二次，每次 5 mins。（室温）9.除去多余液体，滴加100 L 平衡缓冲液，覆盖组织。置于平面，平衡510mins（室温）。10. 置于冰上，除去多余液体，添加 100LTdT 酶反应液，防止干燥。 37，湿盒中孵育 60min，（以使末端标记反应发生） 。（过程中应防止干燥） 。11. 染色缸内 2X SSC浸洗 15mins（用于终止反应） 。（室温）12. P

6、BS 浸洗三次，每次5min，（用于移去未结合的生物素标记的核苷酸）。（室温）13. 0.3%过氧化氢的 PBS中浸洗 3-5min （用以抑制内源性过氧化氢酶） 。（室温）14. PBS浸洗三次，每次 5min。（室温）15. 加 100 LStreptavidinHRP工作液，反应30min。（室温）16. PBS浸洗三次，每次 5min。（室温）17. 加 100 L DAB混合液，直到呈现浅棕色背景，但背景不可太深。18. 去离子水漂洗若干次。19. 用水或永久的封片剂封片， 水封片剂周围用指甲膏封住， 显微镜下观察染色。用于细胞的检测方法需自备：Poly-L-Lysine覆盖的切片：

7、在干净的载玻片表面铺poly- L-lysine（可以 Sigma Cat.# P 892010倍稀释于水制得） ，在所需区域铺一薄层。待干后，迅速以去离子水冲洗，空气干燥30-60mins 。 4可储存7 天。0.2% Triton X-100溶液：Triton X-100溶于 PBSTdT 酶反应液（使用时制备） ：缓冲液成分每标准反应次数（实验成分的体100ul反 应反应+选择性阳积的成分体积性对照）平衡缓冲液98ul×=生物素化的核苷混1ul×=合物rTdT 酶1ul×=2X SSC：用去离子水 1：10 稀释 20XSSCStreptavidinHRP工

8、作液 ：以 PBS500：1 稀释 StreptavidinHRP.DAB混合液（使用时制备，避光，<30mins ）：950ul 去离子水 50ul20XDAB底物缓冲液 50ulDAB 20X色原体50ul20X 过氧化氢步骤：1. 将细胞以 PBS清洗，重悬后铺于 Poly-L-Lysine 覆盖的切片上，组织培养罩内空气干燥约 15mins2. PBS清洗 2 次。（室温）3. 4%多聚甲醛溶液或含 10%福尔马林的 PBS 溶液，或 10%福尔马林浸泡细胞25mins。（室温）4. PBS浸洗二次，每次 5 mins。（室温）5.0.2% Triton X-100溶液浸洗 5m

9、ins。（室温）6. PBS浸洗二次，每次 5 mins。（室温）7. 除去多余液体， 滴加 100L 平衡缓冲液，覆盖组织。置于平面，室温平衡 510mins。8. 置于冰上，除去多余液体，添加 100LTdT 酶反应液，防止干燥。 37，湿盒中孵育 60min，（以使末端标记反应发生） 。（过程中应防止干燥） 。9. 染色缸内 2X SSC浸洗 15mins（用于终止反应） 。（室温）10. PBS 浸洗三次，每次5min，（用于移去未结合的生物素标记的核苷酸）。（室温）11. 0.3%过氧化氢的 PBS中浸洗 3-5min （用以抑制内源性过氧化氢酶） 。（室温）12. PBS浸洗三次，

10、每次 5min。（室温）13. 加 100 LStreptavidinHRP工作液，反应30min。（室温）14. PBS浸洗三次，每次 5min。（室温）15. 加 100 L DAB混合液，直到呈现浅棕色背景，但背景不可太深。16. 去离子水漂洗若干次。17. 用水或永久的封片剂封片， 水封片剂周围用指甲膏封住， 显微镜下观察染色。附：用于细胞的检测方法非试剂盒法TUNEL法检测 SK-N-SH细胞的凋亡1. SK-N-SH细胞于激光共聚焦专用玻璃培养皿中， PBS洗涤，用 4%的多聚甲醛（以 0.1 mol/LNaH 2 PO4 为溶剂，pH=7.4) 固定细胞 15 min ；2. PBS洗涤 3 次，每次 5 min3. 含有 0.5%Tween-20 和 0.2%BSA的 PBS室温孵育 15 min4. PBS洗涤 2 min5. 每孔加入 50 L TdT 混合物 (TdT 缓冲液 Biotin-dUTP TdT 为 90 5 5，体积比，现配现用 ) 室温孵育 60 min6. 吸弃 TdT 混合物，加入 1× TB室温作用 5 min7.PBS洗涤 4 次，每次 2 min ；每孔滴加50 L 的封闭液室温处理20 min8. 现配的 avidin-FITC 溶液 ( 用封闭