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文档简介
1、姜黄素及类似物生物活性的研究乔薇 马林* 中山大学化工学院有机所 510275 摘要 糖尿病作为一种由于血糖高出正常水平所造成的全身性进行性疾病,目前在世界各国已成为越来越普遍的一个公共卫生问题。本文合成了一系列姜黄素类似物,研究其对糖尿病三个靶点(1.醛糖还原酶;2.非酶糖基化;3.氧化应激)的共同抑制作用,得到了很好的活性。关键词 姜黄素ic50醛糖还原酶非酶糖基化抗氧化性research of the biological activities of curcuminoids and analogswei qiao lin ma *school of chemistry and chem
2、ical engineering, sun yat-sen university, 510275, guangzhou, chinaabstract the diabetes, which is a comprehensive and progressive disease caused by high concentration of blood sugar, nowadays has become one of the more and more general public health problems all over the world. a series of curcumin
3、analogous have been synthesized, and were evaluated in vitro for their ability to inhibit aldose reductase,glycation and free radical. it was found that the compounds combined favorably the three biological activities which directly connected to a number of pathological conditions related to the chr
4、onic diabetes mellitus.key words curcuminic50synthesisaldose reductasenonenzymatic glycosation1 前言 糖尿病是一种由于血糖失控高出正常水平所造成的全身性进行性疾病,并发症多且严重。随着生产的发展,生活水平提高及人口寿命的延长,糖尿病发病率迅速增长,已成为世界各国越来越严重的一个公共卫生问题。糖尿病在发生发展过程中,慢性并发症发病率高达96.5%,表现复杂,是导致糖尿病患者致死致残的主要原因。旷日持久的高血糖又将成为一些慢性并发症的病理、生理基础。事实上,糖尿病及其并发症的发病机理十分复杂,至今尚未完
5、全阐明。近年来,在研究糖尿病慢性并发症的发病机制中,三种情况起到了重要的作用 (图1): (i)细胞中山梨醇聚集; (ii) 非酶糖基化终末产物增多;(iii) 氧化应激。 -*基金项目:中山大学化学与化学工程学院第五届创新化学实验与研究基金项目(批准号:28)资助第一作者:乔薇(1983年出生),女,中山大学化学与化学工程学院化工专业2001级指导老师:马林 图1 糖尿病并发症与预防的机理假设ar - 醛糖还原酶; sd - 山梨醇脱氢酶; aris - 醛糖还原酶抑制剂; ros - 活性氧; ages - 非酶糖基化终末产物; p-nh2
6、- 蛋白质. 醛糖还原酶和多元醇(山梨醇)脱氢酶可以组成多元醇通路。ar以nadph为辅酶将葡萄糖和半乳糖还原成相应糖醇-山梨醇和半乳糖醇,然后山梨醇再由多元醇脱氢酶作用将其氧化成果糖。当血糖浓度维持在正常的生理水平时,ar并不被激活。在高血糖的生理状况(如糖尿病发生时),催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖的己糖激酶被饱和。此时ar则被激活,促使体内的葡萄糖转化成山梨醇。然而,山梨醇脱氢酶的活力并未呈比例地相应增加,山梨醇又由于自身极性因素不易通过细胞膜,所以在胞内造成了山梨醇的聚积。山梨醇的聚集引发多种并发症的重要原因。 持续高血糖状态所致体内组织广泛的非酶糖基化(nonenzymatic gl
7、ycosation,neg)产生非酶糖基化终末产物(advanced glycation end products,ages)是引起糖尿病慢性并发症的关键因素。它是由还原糖与蛋白质、氨基酸等的游离氨基端通过一系列复杂的非酶促反应形成结构多样的不可逆聚合物的过程,在反应过程中,伴随着颜色反应,呈现特征性的黄褐色。在高血糖状态下,体内产生大量的ages。ages一经大量形成,在机体内不能及时得到清除,造成ages的累积,严重干扰正常组织的功能与结构。 氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时,自由基的产生和抗氧化防御之间严重失衡,从而导致组织损伤。最近研究显示,氧化应激与糖尿病及其并发症的发生、发展密
8、切相关,应用抗氧化治疗可逆转氧化应激对组织的损伤,从而阻止或延缓糖尿病及其并发症的发生、发展。氧化应激产生的主要机制如下。糖自氧化:葡萄糖自身氧化作用增加,生成烯二醇和二羟基化合物,同时产生大量的。蛋白质的非酶糖化:在非酶促条件下,葡萄糖和蛋白质相互作用形成amadori 产物,然后再形成晚期糖基化终末产物( ages ),ages通过与其受体(rag es)结合,促进ros形成。另外,ages与脂质过氧化密切相关。多元醇通路的活性增高:醛糖还原酶多元醇代谢途径的活化,可降低nadph nadp+,增加nadh nad+比例,消耗还原型gsh,从而诱导ros合成。 目前大部分的研究主要是针对单
9、一靶点的单一抑制剂。我们研究的目的是根据中药的整合作用寻找到一种物质可对糖尿病多靶点的共同抑制作用,以达到更好的治疗效果3。 姜黄素(curcumins)是一种天然食品色素, 主要从姜黄科属植物如姜黄的块根里提取,研究表明其毒害性极低。它们是中药姜黄的主要有效成分,含量约占36。我国主要认为它是一活血化瘀、行气止痛药。极少用于防治糖尿病,所以它防治糖尿病的确切效果和机制值得进一步探讨。我们通过对ar,及非酶糖基化,氧化应激多多靶点的抑制作用的系统研究来证明姜黄素对糖尿病的治疗效果。2 实验内容2.1化合物 2.1.1姜黄素混合物的分离称取姜黄素混合物1g,加入适量四氢呋喃至刚好溶解,加入柱层析
10、用硅胶拌样,挥发干溶剂。称取柱层析用硅胶100g,加入三氯甲烷,湿法灌柱。加拌样后姜黄素混合物于层析柱内,梯度洗脱。洗脱溶剂顺序为:50ml石油醚/200ml三氯甲烷、30ml石油醚/220ml三氯甲烷、20ml石油醚/230ml三氯甲烷、250ml三氯甲烷、1ml甲醇/249ml三氯甲烷、2ml甲醇/248ml三氯甲烷、4ml甲醇/246ml三氯甲烷、8ml甲醇/242ml三氯甲烷、10ml甲醇/240ml三氯甲烷、12ml甲醇/238ml三氯甲烷、14ml甲醇/236ml三氯甲烷、16ml甲醇/234ml三氯甲烷、18ml甲醇/232ml三氯甲烷、20ml甲醇/230ml三氯甲烷,每次洗脱
11、液中加入一滴乙酸。每50ml洗脱液收集一次,用高效薄层层析板点样,1ml三氯甲烷中加入1滴甲醇作为展开液展开,紫外光观测,合并相同组分。旋转蒸发取出溶剂,收集终产物。2.1.2姜黄素类似物的合成方法化合物 a, b, c and d 的合成方法是在现有方法(查阅文献)的基础上修改得到的.本实验采用一步缩和反应。 将相应得醛 (0.01 mol) 和酮混合均匀,然后在搅拌的条件下,缓慢加入适量的盐;30下反应回流两小时。在室温下放置2天,在混合物中加入冷水,沉淀,过滤,得到产物并用适当的溶剂处理,干燥。2.2活性分析2.2.1荧光分光光度法测定化合物对醛糖还原酶抑制活性荧光分光光度计法:反应体系
12、总体积1ml,包括ph6.2 5mmol/l的钠钾磷酸缓冲液、5mmol/l的2-巯基乙醇、0.1mol/l的硫酸锂、0.5mmol/l的dl-甘油醛、0.03mmol/l的nadph和 0.1mg/ml的酶(即0.1mg/35.76mg/ml=3l,实验中采用稀释10倍取30l的方法)。实验管加上述所有试剂,空白管以重蒸水代替dl-甘油醛,ar活性测定以加nadph启动反应。加入nadph后37水浴10min,反应完毕后加入0.3ml 0.5mol/l hcl终止反应,再加入1ml 6mol/l naoh(内含10mmol/l咪唑)充分混匀60加热10min。用光径1cm石英比色杯在荧光分光
13、光度计下记录360nm激发,nadp460nm发射的吸光值的增加来表示ar的活性。称取各样品适量溶解于dmso. 取不同浓度抑制剂作为样品组,其他试剂加入顺序方法同空白组。荧光检测吸光度上升与空白的比值表示抑制活性,抑制后活性对浓度作图求ic50。2.2.2荧光分光光度法测定化合物对非酶糖基化抑制活性牛血清白蛋白(bsa)终浓度为2g/l,nan3终浓度为2.5mmol/l,果糖终浓度200 mmol/l,碳酸缓冲溶液(ph=9.0)终浓度20mmol/l,样品终浓度分别为0,10,25,50,100,150mol/l,每个浓度设置2个平行样;另设对照:以同体积的缓冲溶液代替样品; 不加果糖和
14、样品溶液的纯蛋白组。溶液配制之后,置于50的恒温箱避光孵育10天后取样进行荧光光谱分析。取1.5ml的糖基化溶液用缓冲稀释到3ml,用fls920荧光光谱仪,激发波长为340nm,发射波长为420nm,狭缝为1.5nm,扫描发射光谱,读420nm的荧光强度得出样品管a(f)值。应用以下公式计算化合物对bsa糖基化反应的抑制作用,用抑制百分率(ir)表示:然后以抑制百分率对抑制剂浓度作图,根据抑制曲线求得各种化合物的ic50值(抑制百分率为50时的抑制剂浓度)。2.2.3紫外分光光度法测定化合物对dpph自由基的抑制作用在37下,在25 ml的三角瓶中加入3.9ml的dpph溶液(乙醇溶,浓度为
15、24mg/l),以乙醇做参比,在uv 2501pc紫外分光光度仪上采用扫描程序在240 s内每隔60 s扫描一次。在25 ml的三角瓶中按中的容量配制反应液,混合均匀置于37恒温器中,以20ul样品与3.9ml甲醇为参比在uv 2501pc紫外分光光度仪上采用吸光度测定程序在?nm=515nm处测量dpph分别测不同时间段的吸光度。取20ul样品加入到3.9mldpph中,在37下,不同时间段测515nm吸光度dt。同时测定20ul溶剂与3.9mldpph吸光度do。以logd0/dt为纵坐标,t为横坐标,作吸光度-时间曲线。由此可得出t1/2。k=2.303/t*logd0/d
16、t*1/d 式中k为样品与dpph的反应速率,d为样品的最终浓度,dt为样品与dpph的吸光度,d0为溶剂与dpph的吸光度。3 结果与讨论3.1化合物结构1. curcumin: r1 = r2 = ome2. demethoxycurcumin: r1 = h, r2 = ome3. bisdemethyoxycurcumin: r1 = r2 = h姜黄素类化合物的结构式a系列: b系列 a1: r1=h, r2=oh, r3=h; b1: r1=h, r2=oh, r3=h;a2: r1=oh, r2=oh, r3=h; b2: r1=oh, r2=oh, r3=h;a3: r1= o
17、ch3 r2=oh, r3=h; b3: r1= och3, r2=oh, r3=h;a4: r1=och3, r2=oh, r3=h; b4: r1=och3, r2=oh, r3=h; a5: r1=oc(ch3)3, r2=oh, r3=oc(ch3)3 b5: r1=oc(ch3)3, r2=oh, r3=oc(ch3)3 a6: r1=och3, r2=oh, r3= och3; b6: r1=och3, r2=oh, r3= och3;a7: r1=och3, r2=oh, r3= br b7: r1=och3, r2=oh, r3= brc系列 d系列 c1: r1=h, r2=
18、oh, r3=h; d1: r1=h, r2=oh, r3=h;c2: r1=oh, r2=oh, r3=h; d2: r1=oh, r2=oh, r3=h;c3: r1= och3 , r2=oh, r3=h; d3: r1= och3, r2=oh, r3=h;c4: r1=och3, r2=oh, r3=h; d4: r1=och3, r2=oh, r3=h; c5: r1=oc(ch3)3, r2=oh, r3=oc(ch3)3 d5: r1=oc(ch3)3, r2=oh, r3=oc(ch3)3c6: r1=och3, r2=oh, r3= och3; d6: r1=och3, r
19、2=oh, r3= och3;c7: r1=och3, r2=oh, r3= br d7: r1=och3, r2=oh, r3= br3.2 活性分析姜黄素及类似物对醛糖还原酶,非酶糖基化,氧化应激抑制活性测试结果compdr1r2r3ariic50(m)/ari%(m)ages inhibitionic50 (m)/%( m)dpphic50 (m)1och3och36.830.535.62och3h15.935.047.83hh13.732.021.6% (75 m)a1hohh18.6 19.28.6% (63 m)a2ohohh1.9 5.1 1.5 a3 och3ohh17.918
20、.517.2 a4oc(ch3)3ohoc(ch3)335%(86 m)b24.3%(75 m)32.6 a5och3 och3h11%(98 m)6% (95 m)3% ( 82 m)a6och3ohoch316.973.2 28 a7brohoch314.2 44.336.8% (62m)b1hohh18.6 21.5 13% ( 72m)b2ohohh2.5 10.6 1.9 b3 och3ohh16.0 13.8 9.5 b4oc(ch3)3ohoc(ch3)325% (87 m)21% (85 m)22.3 b5och3 och3h6% (75 m)11% (93 m)a4% (64
21、 m)b6och3ohoch320.0 61.5 6.6 b7brohoch314.1 43.2 45% (73 m)c1hohh22.4 16.2 8.6% (66 m)c2ohohh2.2 9.4 2.9 c3 och3ohh24.4 23.4 17.1 c4oc(ch3)3ohoc(ch3)338% (95 m)29.7 14.6 c5och3 och3h6% (92 m)8% (98 m)2.5% (78 m)c6och3ohoch315.9 63 32.6c7 brohoch314.8 49.0 32.5% (66 m)d1hohh21.2 24.511.2% (65m)d2ohoh
22、h9.018.1 1.7 d3 och3ohh14.2 53.79.8 d4oc(ch3)3ohoc(ch3)323.3 42% (100 m)27.2 d6och3ohoch319.9 61.514.6 d7brohoch313.7 43.243% (54 m)由图中测试结果可知姜黄素1,2,3以及合成的姜黄素类似物a系列到d系列大部分对醛糖还原酶,非酶糖基化,氧化应激有明显的抑制作用。实验中抑制率用ic50值(抑制百分率为50时的抑制剂浓度)来表示,其中有些化合物的抑制效果不好的我们用在一定浓度下的抑制百分率来表示,如化合物a4在86m下对醛糖还原酶的抑制率是35%。同时我们选用化合物槲皮
23、素(ic50=37.6)作为醛糖还原酶抑制剂的对照药物;选用了氨基胍(ic50=483.0)作为我们非酶糖基化抑制剂的对照药物,氨基胍(ag)已被公认为最有临床应用前景的干预ages的药物。首先可以看出,天然的姜黄素分离产物(1,2, 3)对醛糖还原酶都有很明显的抑制作用,特别是姜黄素1,ic50=8.6m,抑制效果最好,是槲皮素抑制率的1/4。然后,根据姜黄素的结构,合成出一系列的姜黄素类似物。这类化合物的结构类似,都含有对称的芳香集团。化合物a5,b5,c5在100m时对醛糖还原酶的抑制作用非常微小,基本上可以忽略其抑制作用。其余的化合物都对醛糖还原酶有很好的抑制作用(ic50=1.9-2
24、3.3),除了化合物a4,b4,c4的溶解性不好。同时发现化合物a5,b5,c5的结构中只有-och3集团,而不像其他化合都有-oh。结构中都含有四羟基的化合物a2,b2,c2ic50值只有槲皮素的1/20,抑制作用最好。实验结果证明:羟基或邻羟基集团的存在对醛糖还原酶的抑制起到了重要的作用。同样,各系列化合物对非酶糖基化都有不同程度的抑制作用,首先,苯环含有邻羟基的一组化合物(a2,b2,c2,d2)抑制作用最强;其次在苯环上含有单羟基的各化合物中, a1,b1,c1,d1和a3,b3,c3的抑制作用较强,它们的结构中不含有烷基或只含有一个烷基。而苯环上含有-oc(ch3)3的化合物a4,b
25、4,d4的抑制作用不好,可能由于空间位阻较大,并且是给电子集团,使羟基的抑制作用降低。同样,各系列中化合物7(带有-br)的抑制作用好于化合物6,吸电子集团-br使化合物结构更趋于稳定,并且位阻小;最后,苯环上不含羟基的化合物a5,b5,c5基本上没有非酶糖基化的抑制作用。在dpph常温体系中,所测得的姜黄素类化合物大部分表现出显著的抗氧化作用,由结果可看出,有邻羟基的物质抗氧化作用最强,可见邻羟基对捕捉dpph自由基的能力很强。其次为羟基旁边有增加中心原子负电性的基团的化合物。四类化合物中,r1或r2为och3时的效果普遍比r1或r2为oc(ch3)3时的效果好,原因可能为-och3的给电子
26、能力比虽然没-oc(ch3)3强,但由于后者空间位阻比前者大,导致整个分子结构不稳定。而化合物中羟基周围无给电子基团或有吸电子基团如(-br)时,物质的抗氧化效果明显下降,苯环上无羟基的物质则基本无抗氧化效果。最后得出结论姜黄素及其姜黄素类似物对糖尿病并发症的三个靶点都有明显的抑制作用,特别是苯环上含有邻羟基的化合物a2,b2,c2对醛糖还原酶,非酶糖基化都有很好的抑制作用,并且有很好的抗氧化效果。实验结果表明姜黄素及其类似物具有中药的整合作用,对糖尿病并发症进行多靶点共同抑制,有可能成为糖尿病有效的治疗药物,有进一步深入研究的价值。致谢本论文是在马林教授,杜志云博士的悉心指导下完成的,在此表示深深的感谢。感谢中山大学化学与化学工程学院创新实验与研究基金的资助!参 考 文 献【1】costanitino, l.; rastelli, g.; vianello, p.; cignar
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