第7章第4节分子杂交和印迹技术3LMJ

1、基因操作基因操作第七章第七章gene manipulatinggene manipulating2021年年11月月3日日0时时20分分12021年年11月月3日日0时时20分分2molecular blotting & hybridization technology2021年年11月月3日日0时时20分分3 marmum marmum和和doty1961doty1961年发现的年发现的dnadna变性复性现象变性复性现象是核酸杂交技术的理论基础。是核酸杂交技术的理论基础。(heteroduplex)2021年年11月月3日日0时时20分分4一、印迹技术一、印迹技术(blotting

2、)u19751975年年edwen southernedwen southern建立的建立的dnadna印迹杂交。印迹杂交。 指将电泳凝胶中的生物大分子转移指将电泳凝胶中的生物大分子转移( (印迹印迹) )于固定于固定化介质如化介质如硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜上并加以检测分析的技术。上并加以检测分析的技术。支持物支持物转转移移缓缓冲冲液液纸纸巾巾玻璃板玻璃板500g（1 1）印迹：）印迹：电转移电转移真空负压吸引转移真空负压吸引转移whatmanwhatman滤纸滤纸凝胶凝胶whatmanwhatman滤纸滤纸重物重物ncnc膜或尼龙膜膜或尼龙膜毛细作用转移毛细作用转移2021年年11月月3日日

3、0时时20分分5 ncnc膜上载有的膜上载有的dnadna单链分子就可以在杂交液中单链分子就可以在杂交液中与另一种与另一种dnadna或或rnarna分子分子( (称为探针，可用同位素或称为探针，可用同位素或非非同位素同位素标记标记) )进行杂交。进行杂交。 具有互补序列的具有互补序列的rnarna或或dnadna标记探针结合到存在标记探针结合到存在于于ncnc膜的膜的dnadna分子上，经放射自显影或其他检测技分子上，经放射自显影或其他检测技术就可以显现杂交分子的有无和位置。术就可以显现杂交分子的有无和位置。（2 2）杂交：）杂交：（3 3）显示：）显示：2021年年11月月3日日0时时20

4、分分6（1）特定基因序列的定性和定量分析）特定基因序列的定性和定量分析u核酸分子杂交应用核酸分子杂交应用（2）基因克隆的筛选）基因克隆的筛选（3）酶切图谱的制作）酶切图谱的制作（4）基因突变分析）基因突变分析（5）疾病的诊断）疾病的诊断2021年年11月月3日日0时时20分分7二、探针的种类和制备二、探针的种类和制备探针探针(probe)的概念：的概念： 用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列用来检测某一特定核苷酸序列或基因序列的的dna或或rna的的互补标记片段：互补标记片段： 与待测与待测特定核苷酸特定核苷酸的某一段序列相的某一段序列相互互补；补； 有明确的标志用于后续的检测。有明确的标志用

5、于后续的检测。2021年年11月月3日日0时时20分分8探针的种类探针的种类寡核苷酸探针寡核苷酸探针基因组基因组dna探针探针cdna探针探针rna探针探针（一）常用探针的种类（一）常用探针的种类dna探针探针2021年年11月月3日日0时时20分分91dna探针探针双链探针双链探针: :单链探针单链探针 从克隆在质粒载体中的特异性基因片段制备；从克隆在质粒载体中的特异性基因片段制备；优点则是容易制备。优点则是容易制备。 用化学法合成或从克隆在用化学法合成或从克隆在m13噬菌体的特异性噬菌体的特异性基因片段制备；基因片段制备；优点是优点是在杂交反应中可以排除互补在杂交反应中可以排除互补链的干扰

6、。链的干扰。2021年年11月月3日日0时时20分分102rna探针探针早期采用细胞早期采用细胞mrnamrna和病毒和病毒rnarna作探针作探针 主要用于研究目的，而不是用于检测。如筛选主要用于研究目的，而不是用于检测。如筛选hiv的基因组的基因组dna克隆、进行中的克隆、进行中的转录分析转录分析等式。等式。 与与dna单链探针相比，单链探针相比，rna探针具有标记效探针具有标记效率高、易于纯化、成本低和杂交信号强等优点率高、易于纯化、成本低和杂交信号强等优点 标记是在细胞基因转录或病毒复制过程，效率标记是在细胞基因转录或病毒复制过程，效率往往不高，且受多种因素的制约。往往不高，且受多种因

7、素的制约。2021年年11月月3日日0时时20分分11（二）核酸探针的标记（二）核酸探针的标记 根据是否使用放射性标记物可分为放射性标记和根据是否使用放射性标记物可分为放射性标记和非放射性标记；根据标记物掺入情况可分为均匀标记非放射性标记；根据标记物掺入情况可分为均匀标记和末端标记探针。和末端标记探针。理想标记物理想标记物应备条件应备条件不影响碱基对特异性不影响碱基对特异性有较高的化学稳定性有较高的化学稳定性检测方法高度特异、灵敏检测方法高度特异、灵敏标记及检测方法简单标记及检测方法简单环保，无损害环保，无损害价格低廉价格低廉2021年年11月月3日日0时时20分分12优点优点缺点缺点灵敏度和

8、特异性极高灵敏度和特异性极高半衰期短半衰期短, 随用随标随用随标1.1.放射性同位素标记探针放射性同位素标记探针对各种酶促反应无任何影响对各种酶促反应无任何影响不影响碱基配对的特异性与稳定性不影响碱基配对的特异性与稳定性放射性污染放射性污染 用于核酸探针标记的放射性同位素主要用于核酸探针标记的放射性同位素主要有有32p、3h和和35s等；等；32p应用最多。应用最多。2021年年11月月3日日0时时20分分13 32p的放射性较强，放射自显影所需时间较短，的放射性较强，放射自显影所需时间较短，灵敏度高，可广泛应用于各种印迹杂交。灵敏度高，可广泛应用于各种印迹杂交。 缺点是半衰期短缺点是半衰期短

9、( (14.3天天) )，射线散射严重，放，射线散射严重，放射自显影后射自显影后x胶片上的信号有时边缘不清。胶片上的信号有时边缘不清。r-32p atpa-32p datp*3h2datp2021年年11月月3日日0时时20分分14(1) dna(1) dna切口平移切口平移 标记法标记法2021年年11月月3日日0时时20分分15u核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法dna酶酶：在双：在双链链dnadna上随机打开上随机打开若干个单链缺口，若干个单链缺口，产生产生3 3-oh-oh端。端。大肠杆菌大肠杆菌dna聚聚合酶合酶：5 533 dnadna聚合酶活性；聚合酶活性； 5 533 外切核

10、酸外切核酸酶活性。酶活性。dnadna切口平移标记法示意图切口平移标记法示意图2021年年11月月3日日0时时20分分16(2) dna随机引物标记法随机引物标记法2021年年11月月3日日0时时20分分17随机引物随机引物：含有各种：含有各种可能排列顺序的寡核可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。苷酸片段的混合物。46=4096dna聚合酶聚合酶klenowklenow片段片段：保留：保留5 533 dnadna聚合酶活性聚合酶活性, ,弱弱3 355外切酶活性，外切酶活性，无无5 533外切酶活性。外切酶活性。dna随机引物标记法示意图随机引物标记法示意图2021年年11月月3日日0时时20

11、分分182021年年11月月3日日0时时20分分195 3 3 5 完整双链完整双链dna限制性内切酶限制性内切酶5 3 3 5 -32p-dntp其他其他3 种种dntpklenow dna聚合酶聚合酶5 3 3 5 变性变性5 3 3 5 5 末端突出末端突出的的dna3 末端标记的末端标记的dna32p-末端标记的末端标记的单链单链dna探针探针1) dna的的3末端标记末端标记(3) dna的末端标记的末端标记2021年年11月月3日日0时时20分分20 条件是有条件是有5-ohoh存在，人工合成寡核苷酸最常用；存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链双链dnadna需用碱性磷酸酶切除需用碱

12、性磷酸酶切除5-p p后再标记后再标记5pcpgptpa35ho-cpgptpa3t4噬菌体多核苷酸激酶噬菌体多核苷酸激酶-32p-atp532p-o-cpgptpa337，反应，反应10min, -32p-atp 需需150 ci/反应反应2) dna的的5末端标记末端标记碱性磷酸酶碱性磷酸酶2021年年11月月3日日0时时20分分21标记探针的纯化标记探针的纯化凝胶过滤层析凝胶过滤层析 常用的凝胶基质：常用的凝胶基质：sephadex g-50sephadex g-50、bio-gel p-60bio-gel p-60选择性沉淀选择性沉淀 乙醇存在，醋酸铵可起此作用。乙醇存在，醋酸铵可起此

13、作用。2021年年11月月3日日0时时20分分22u核酸探针的标记方法核酸探针的标记方法(1) dna切口平移标记法切口平移标记法(2) dna随机引物标记法随机引物标记法(7) rna探针的标记探针的标记(3) dna的末端标记的末端标记(4) cdna探针的标记探针的标记(5) 寡核苷酸探针的标记寡核苷酸探针的标记(6) 单链单链dna探针的标记探针的标记2021年年11月月3日日0时时20分分232. 2. 非放射性标记物非放射性标记物优点优点缺点缺点灵敏度较灵敏度较放射性同位素标记低放射性同位素标记低无放射性污染无放射性污染 用于核酸探针标记的用于核酸探针标记的非放射性标记物非放射性标

14、记物主主要有要有生物素生物素、地高辛和荧光素地高辛和荧光素( (fitc、罗丹、罗丹明明) )等。等。稳定性好稳定性好, ,可较长时间存放可较长时间存放特异性较特异性较放射性同位素标记低放射性同位素标记低2021年年11月月3日日0时时20分分242021年年11月月3日日0时时20分分25the method used to produce nonradioactive dna molecules that carry a specific chemical marker that can be detected with an appropriate antibody.biotin-avi

15、din systemdig-dutp 电泳电泳, ,转膜，转膜，紫外交联固定紫外交联固定d dd d2021年年11月月3日日0时时20分分26ohnhhnshhoo关于生物素关于生物素2021年年11月月3日日0时时20分分27杂交：生物杂交：生物素标记的探针素标记的探针与靶与靶dnadna结合结合底物在底物在hrphrp催催化下化下, ,反应发光反应发光洗膜封闭洗膜封闭电泳电泳, ,转膜，转膜，紫外交联固定紫外交联固定sasahrphrp底物底物b bb bhrphrp标记的链标记的链亲和素与探针上亲和素与探针上的生物素结合的生物素结合2021年年11月月3日日0时时20分分281.1.曝

16、光：曝光：用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记，用滤纸吸去杂交膜上多余底物，作好标记， 保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上保鲜膜包裹，放在暗夹里，放上x x光片，曝光光片，曝光1-51-5 分钟；分钟；2.2.显影：显影：取出取出x x光片，按使用说明书显影和定影。光片，按使用说明书显影和定影。后继的化学发光检测后继的化学发光检测 luminol化学发光原理化学发光原理 2021年年11月月3日日0时时20分分29思考题思考题：三、印迹技术的种类和用途三、印迹技术的种类和用途（一）（一）dnadna印迹杂交技术印迹杂交技术（二）（二）rnarna印迹杂交技术印迹杂交技术（四）蛋白质印迹杂交技术（四）

17、蛋白质印迹杂交技术（三）其它核酸印迹杂交技术（三）其它核酸印迹杂交技术2021年年11月月3日日0时时20分分302021年年11月月3日日0时时20分分312021年年11月月3日日0时时20分分322021年年11月月3日日0时时20分分332021年年11月月3日日0时时20分分342021年年11月月3日日0时时20分分35 将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上将菌落或噬菌斑影印在尼龙膜上( (以前用硝酸纤以前用硝酸纤维膜维膜) )，这种膜只吸附单链，这种膜只吸附单链dnadna； 用用naohnaoh处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可处理，这样不仅可以杀死细菌，同时可使使dnadna变性吸附

18、在膜上；变性吸附在膜上； 用无关的单链用无关的单链dnadna，如小牛胸腺，如小牛胸腺dnadna和鲑鱼精子和鲑鱼精子dnadna预杂交。预杂交。 膜经中和后再将标记探针和膜放在缓冲溶液中膜经中和后再将标记探针和膜放在缓冲溶液中缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。缓缓复性，经放射自显影来确定阳性菌落。2021年年11月月3日日0时时20分分362021年年11月月3日日0时时20分分372021年年11月月3日日0时时20分分38screening a genomic library by colony hybridization.2021年年11月月3日日0时时20分分39限制酶切位点限制

19、酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos lr coscos l左臂左臂r cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体dna限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源dna与载体与载体dna混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 kb dna 片段片段 cos lr cos20 kb 外源外源 dna 片段片段 gdna文库文库11/3/2021 12:20 am402021年年11月月3日日0时时20分分412021年年11月月3日日0时时20分分42(1)(1)蛋白样品的制备蛋白样品的制备(2) (2) sds-

20、pagesds-page(3)(3)转膜转膜(4)(4)封闭封闭(5)(5)抗体杂交及抗体杂交及 底物显色底物显色蛋白样品的制备蛋白样品的制备2021年年11月月3日日0时时20分分441m tris-hcl(ph6.8)10 ml1m dtt20 mlsds4 g甘油甘油20 ml溴酚蓝溴酚蓝0.2 g总体积总体积100ml100mm tris-hcl(ph6.8)200mm dtt4%sds20%甘油甘油0.2%溴酚兰溴酚兰ddh2o2sds-page上样缓冲液：上样缓冲液： 按按1:1与蛋白质样品混合，与蛋白质样品混合，95-100加热加热5-15min，冰上冷却后，上样冰上冷却后，上样

21、20-25l，总蛋白量，总蛋白量20-50g。2021年年11月月3日日0时时20分分46staking gelseparating gel（2 2）sdssds聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳2021年年11月月3日日0时时20分分47湿转系统湿转系统（3 3）转膜）转膜2021年年11月月3日日0时时20分分48半干转移系统半干转移系统2021年年11月月3日日0时时20分分49常用的蛋白质转移膜常用的蛋白质转移膜种类种类 微孔大小微孔大小 结合能力结合能力 特点特点ncnc膜膜0.45 um 80-100 ug/cm2应用广泛 20kd易丢失pvdfpvdf膜膜0.22 um0.22 um 80-100 ug/cm2170-200 ug/cm2 20kd不易丢失容量大、强度高尼龙膜尼龙膜 4